包埋花色苷的海藻酸鈣-乳清分離蛋白 復配凝膠的制備與表征

宋江流，楊靜怡，高彥祥，毛立科

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

花青素是一種水溶性色素，屬于類黃酮的酚類化合物，自然條件下花青素很少單獨存在，一般與一個或 多個糖類物質以糖苷鍵形式連接形成花色苷?；ㄉ論碛锌寡趸?、抗衰老、維護心血管健康、預防慢性疾病等多種保健功能，在食品、醫藥和美妝領域有很好的應用前景[1]。花色苷的穩定性易受到pH值、溫度、光照和金屬離子等因素影響[2]。常用的提升花色苷穩定性方法包括化學改性、添加輔色劑和凝膠包埋法[3]，其中凝膠包埋法因為對花色苷結構影響小，并對環境友好，而受到越來越多的關注。

海藻酸鈉，又稱藻酸鈉、海草酸鈉，主要存在于海藻細胞間質和細胞壁中。海藻酸鈉中G單元上的Na＋可以通過與二價金屬陽離子發生置換反應形成水凝膠。海藻酸鈉的增稠性和凝膠性，使其在食品制備、藥品研發和功能因子包埋等領域應用廣泛。僅由海藻酸鈉制備的凝膠機械性能差、持水能力弱，其黏彈性受聚合度影響較大，在實際包埋功能因子的應用過程中往往存在鈣化膜機械性能差、包埋功率低、貯存過程中易破裂等缺點[4]?，F代科學常采用將海藻酸鈉與其他高分子材料復配的方式改善單一海藻酸鹽的不足，常用的復配物包括蛋白質、多糖和脂質。倪芳芳[5]以海藻酸鈉和明膠為壁材，制備了包埋植物乳桿菌JYLP-326和姜黃素的水凝膠珠，結果顯示，復配包埋能有效提升包埋物的貯存穩定性和熱穩定性。Komoto等[6]使用海藻酸鈉和殼聚糖制備了新型聚電解質復合物凝膠，結果顯示：復配凝膠展現出更高的彈性模量。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）由乳清蛋白經過物理加熱，化學離子交換等多種方式處理得到，蛋白質含量不小于90%，主要組分包括β-乳球蛋白、α-乳白蛋白等[7-8]。WPI凝膠方式分為熱致凝膠和冷凝膠兩種：前者通過蛋白在熱處理條件下發生去折疊，疏水基團大量聚合而形成三維網狀凝膠結構；后者則是在室溫下利用酸、鹽或酶對蛋白進行誘導形成凝膠體系[9]。由蛋白質與多糖復配的方式制備凝膠可獲得更好的機械性質、持水力、功能因子包埋釋放性和結構穩定性[10]。Jie Yu等[11]使用黃原膠與大豆分離蛋白制備凝膠，發現復配凝膠可獲得高硬度的3D打印食品。

目前，關于制備條件對海藻酸鈉和WPI復配凝膠各項性質影響的研究還鮮有報道。本實驗采用原位釋放法制備包埋花色苷的海藻酸鈣-WPI復配凝膠，探究原料不同處理方式下海藻酸鈣-WPI復配凝膠的性質（如微觀結構、流變學特性、質構特性、持水力、凍融穩定性和紅外光譜）和對花色苷的保護效果，以改善單一海藻酸鹽凝膠的應用效果，為多糖-蛋白復配凝膠的開發提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉（分析純）上海麥克林生化科技股份有限公司；WPI 加拿大Agropur公司；藍莓花色苷（食 品級）廣東圣嘉德生物技術公司；葡萄糖酸-δ-內酯（食品級）安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設備

PL602-S電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 北京長風儀器儀表公司；CT3物性分析儀 美國Brookfield公司；SZCL-2數顯智能控溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；AR-1500ex流變儀 美國TA公司；Spectrum 100型傅里葉變換紅外分光光度計 美國Perkin-Elmer公司；S-3000N場發射電子掃描顯微鏡 日本Hitachi公司；Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥器 德國Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 包埋花色苷的海藻酸鈣凝膠的制備

原位釋放制備海藻酸鹽凝膠的方法參照陳鴻強等[12]并稍作修改。制備質量分數1%的海藻酸鈉溶液，之后加入一定濃度花色苷溶液使其在海藻酸鈉溶液中質量分數達到0.2%。隨后將混合溶液、質量分數1%碳酸鈣懸浮液和新鮮制備的質量分數9%葡萄糖酸-δ-內酯溶液按質量比10∶2∶1混合，其中碳酸鈣懸浮液在加入前需超聲2 min。溶液混合后迅速以200 r/min攪拌至完全固化，之后靜置凝膠24 h，待性質穩定后進行相關指標測定[12]，記 為CA組。

1.3.1.2 包埋花色苷的海藻酸鈣-WPI復配凝膠的制備

制備質量分數2%的海藻酸鈉溶液和質量分數10%的WPI溶液，其中WPI溶液中還應含有質量分數0.01%的疊氮化鈉（防止微生物的生長）。之后以1∶1的質量比將兩者混合均勻并加入一定濃度花色苷溶液，使花色苷在混合溶液中質量分數達到0.2%，隨后將含花色苷的海藻酸鈉-WPI混合溶液，質量分數1%碳酸鈣懸浮液和新鮮制備的質量分數9%葡萄糖酸-δ-內酯溶液按質量比10∶2∶1混合，其中碳酸鈣懸浮液在加入前需超聲2 min。混合溶液以200 r/min攪拌至完全固化，之后靜置凝膠24 h，待性質穩定后進行相關指標測定，記為CA-WPI組。

1.3.1.3 包埋花色苷的海藻酸鈣-熱處理WPI復配凝膠的制備

制備質量分數2%的海藻酸鈉溶液和質量分數10%的WPI溶液，其中WPI溶液中還應含有質量分數0.01%的疊氮化鈉（防止微生物的生長）。將制備好的WPI溶液放入4 ℃冰箱中水合過夜，之后取出在85 ℃水浴中加熱30 min，然后迅速在冰水中冷卻到室溫。后續關于原料溶液混合、添加花色苷溶液以及凝結成膠的操作與1.3.1.2節一致，記為CA-熱WPI組。

1.3.1.4 包埋花色苷的共熱海藻酸鈣-WPI復配凝膠的制備

制備質量分數2%的海藻酸鈉溶液和質量分數10%的WPI溶液，其中WPI溶液中還應含有質量分數0.01%的疊氮化鈉（防止微生物的生長）。將制備好的WPI溶液放入4 ℃冰箱中水合過夜。之后，以1∶1的質量比將兩者混合均勻并在85 ℃水浴中加熱30 min，然后迅速在冰水中冷卻到室溫。再加入一定濃度花色苷溶液使其在混合溶液質量分數達到0.2%，后續關于凝結成膠的操作與1.3.1.2節一致，記為共熱CA-WPI組。

1.3.2 掃描電子顯微鏡觀察

使用場發射掃描電鏡，觀察1.3.1節制備的4 種凝膠形貌特征。挑取少量冷凍干燥后的凝膠固定于掃描電子顯微鏡樣品盤上的導電雙面膠帶上，之后真空噴金，不同樣品之間使用刻刀分割膠帶以便區分觀察。設定加速電壓10 kV，放大倍數50、200、500 倍和2000 倍，對凝膠的剖面進行形貌觀察[13]。

1.3.3 脫水收縮率和凍融穩定性測定

采用1.3.1節方法制備4 種凝膠，將攪拌均勻且尚未固化的原料混合溶液迅速倒入5 mL離心管中，控制每個離心管中凝膠的質量在6.00～7.00 g之間。于室溫下穩定24 h后，將凝膠25 ℃、10000 r/min離心15 min，將管中凝膠輕輕取出，用吸水紙吸去凝膠表面水分后稱質量[14]。按下式計算凝膠的脫水收縮率：

式中：m0為空離心管質量/g；m1為樣品和離心管總質量/g；m2為吸干表面水分后樣品和離心管總質量/g。

以凝膠凍融后的持水力代表其凍融穩定性。采用1.3.1節的方法制備4 種凝膠，將攪拌均勻且尚未固化的原料混合溶液迅速倒入5 mL離心管中，控制每個離心管中凝膠的質量在6.00～7.00 g之間。于室溫下穩定24 h后，放入-20 ℃冰箱中冷凍36 h，隨后于室溫下解凍3 h。解凍后擦去離心管表面水分，稱取離心管和樣品總質量，25 ℃、10000 r/min離心15 min，將凝膠滲出水分用吸水紙擦凈，稱取剩余凝膠和離心管總質量[15]。按下式計算凝膠凍融后持水力：

式中：ma為空離心管質量/g；mb為樣品和離心管總質量/g；mc為離心除水后樣品和離心管總質量/g。

1.3.4 流變學性質測定

采用1.3.1節方法制備4 種凝膠，制成厚度為2 mm，直徑為40 mm的薄片。使用流變儀研究凝膠流變性質，測量溫度25 ℃，采用直徑40 mm的平行板，間隙為1 mm。1）應變掃描：設置應變范圍0.02%～100%，固定頻率1 Hz，應變0.1%，觀察凝膠的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）隨應變的變化情況，記錄不同凝膠的線性黏彈區。2）頻率掃描：設置頻率范圍0.1～100 Hz，應變0.1%，觀察凝膠G′和G″隨頻率的變化情況[16]。3）蠕變-回復測定：施加應力2 Pa，保持180 s，撤去應力后保持360 s觀察凝膠恢復情況。蠕變柔量（J）可以用來表征單位應力作用下凝膠形變量大小，按下式計算量蠕變-回復率：

式中：J1為180 s蠕變柔量/（1/Pa）；J2為540 s蠕變柔量/（1/Pa）。

1.3.5 機械性質測定

采用1.3.1節方法制備混合液，并在25 mL燒杯（內徑34 mm，高50 mm）中成膠，保證每個燒杯中凝膠的高度相同。使用物性分析儀，通過單軸壓縮測試評價凝膠的機械性能。使用直徑為12 mm的圓柱形柱塞探頭，以測試速率1 mm/s、壓縮距離7 mm對凝膠進行測試，記錄樣品的硬度和黏性數據。測試速率1 mm/s、壓縮距離3 mm條件下，在探頭達到最大位移后維持60 s，獲得樣品的應力松弛曲線，并將實際曲線進行非線性擬合[17]。

1.3.6 紅外光譜測定

分別稱量2 mg經冷凍干燥處理的凝膠樣品和198 mg溴化鉀粉末，倒入瑪瑙研缽中研磨均勻，于20 MPa壓力下保壓1 min制成壓片[18]。以純溴化鉀壓片作為空白對照，掃描范圍4000～400 cm-1，掃描32 次，分辨率4 cm-1。

1.3.7 貯存穩定性測定

采用1.3.1節方法制備4 種凝膠，將攪拌均勻且尚未固化的原料混合溶液迅速倒入5 mL離心管中，控制每個離心管中凝膠質量在6.00～7.00 g之間。分別保持在25 ℃和4 ℃的黑暗中貯藏15 d，每3 d測定一次花色苷含量。

花色苷含量測量：取0.1 g凝膠加入4 mL pH 6.80.2 mol/L磷酸鹽緩沖液中，浸泡24 h使凝膠充分破碎，室溫下超聲1 min，隨后再加入4 mL含0.1 mol/L鹽酸的95%乙醇溶液，放置24 h，使凝膠充分解離[19]。隨后于25 ℃、10000 r/min離心15 min，取上清液備用。采用pH值示差法測定上清液中花色苷質量濃度，按下式計算花色苷保留率：

式中：c1為上清液中花色苷質量濃度/（mg/L）；V1為上清液總體積/L；c0為第0天上清液中花色苷質量濃度/（mg/L）；V0為第0天上清液總體積/L。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的微觀結構分析

由圖1可知，CA組呈半透明狀的紅紫色，其余3 組呈逐步變淺的紫色。顏色的變化與體系pH值有關，當存在H＋或OH-時，花色苷微觀能帶變動，其分子結構中π電子分布狀態改變，對光的吸收的反射發生變動，從而呈現出不同的顏色[20]。pH＜7時，花青素呈紅或粉色；pH 7～8時，花青素呈紫色。凝膠由紅色向紫色的轉變，初步說明WPI的添加可使體系堿性增強達到中性。此外，CA-熱WPI組和共熱CA-WPI組的凝膠呈現出泛白跡象，這是熱處理增加蛋白質之間的相互作用，導致更多的蛋白質聚集的標志[21]。

圖1 不同樣品的凝膠外觀Fig.1 Appearance of different gel samples

由圖2可知，CA組凝膠切面呈蜂窩狀結構，中空孔徑大小在50 μm左右（圖2C1），整體較為致密規則，凝膠表面光滑平整無突起（圖2D1）。CA-WPI組中，WPI的加入未改變海藻酸鈣凝膠整體的蜂窩狀結構，但增加了中空孔徑的大小，孔徑大小在100 μm左右（圖2C2），凝膠網絡表面出現顆粒狀聚集蛋白質，蛋白聚集體稀疏散布在海藻酸鈣表面，彼此不粘黏（圖2D2）。CA-熱WPI組凝膠切面的蜂窩狀結構出現坍塌（圖2A3），凝膠表面變得粗糙（圖2D3）。WPI經過熱處理后天然結構被破壞，蛋白質鏈展開，其色氨酸基團暴露[9]，并且暴露更多羥基、羧基、醛基等親水基團，這些可與海藻酸鈣凝膠之間形成生物黏附狀態[22]。共熱CA-WPI組凝膠切面不再呈現蜂窩狀特點（圖2A4），凝膠網絡表面聚集大量形態規則的球狀聚集蛋白質顆粒，彼此間緊密相連（圖2D4）。高溫處理有利于物質間的疏水相互作用，并且降低了海藻酸鈉聚合物的黏性，WPI可以更好附著并穩定海藻酸鈣的分子間連接區，有助于形成更密集的網絡結構，同時影響海藻酸鈣凝膠網絡的形成。

圖2 不同放大倍數下的凝膠形貌Fig.2 Micromorphology of gels at different magnifications

2.2 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的脫水收縮率和凍融穩定性分析

由表1可知，CA組和CA-WPI組的脫水收縮率最大，CA-熱WPI組最小。由于實驗采用內源法制備凝膠，不溶性的碳酸鈣提供鈣源可以使得形成的凝膠結構均勻，但也會導致碳酸鈣嵌入新形成的凝膠中，限制鈣離子的擴散從而影響凝膠化[23]。凝膠中不溶性的碳酸鈣減弱了凝膠對水的吸收，而未加熱的WPI內部親水基團沒有展開，氨基酸殘基處于相對疏水環境，蛋白與海藻酸鈉結合弱，因此CA組和CA-WPI組的持水力最差。熱處理后的WPI與海藻酸鹽形成相互作用的凝膠網絡，伴隨凝膠化的聚合物構象變化，水分子可以在海藻酸鈣和WPI之間重新分配[24]，水分移向親水性WPI，增加了凝膠持水力。此外，加熱過程會加劇水分子的熱運動，導致水分子向空氣中揮發，共熱CA-WPI組成膠后體系內水分總量減少，因此最終形成的凝膠中CA-熱WPI組脫水收縮率最小，共熱CA-WPI組次之。分析凝膠凍融后的持水力可知，CA-熱WPI組和共熱CA-WPI組較CA-WPI組和CA組的持水力顯著提升，CA-熱WPI組凍融后持水力較對照組提升36.37%。未加熱WPI作為雙凝膠體系的填充物在低溫條件下不能提升凝膠的持水力?？赡苁怯捎诩訜峥梢源呋鞍變炔炕瘜W鍵展開，有利于形成分子間和分子內共價鍵，從而提高蛋白質凝膠的水合能力[25]，此結果與脫水收縮率的分析結論一致。

表1 不同樣品的脫水收縮率和凍融后持水力Table 1 Dehydration shrinkage rates and water-holding capacity after freezing-thawing of different gel samples %

2.3 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的流變學性質分析

由圖3A可知，不同樣品的G′和G″呈現相似的變化趨勢。在一定應變范圍內（0.02%～3.00%），復配凝膠的G′均大于G″，說明此時4 組樣品以彈性為主。G′隨應變增大而保持平穩的應變范圍是凝膠的線性黏彈區。由圖3A可知，CA組線性黏彈區為0.02%～0.1913%，CAWPI組線性黏彈區為0.02%～2.252%，CA-熱WPI組線性黏彈區為0.02%～2.619%，共熱CA-WPI組線性黏彈區為0.02%～2.568%；由此可見，WPI添加能有效增大凝膠的線性黏彈區范圍，并且添加熱處理WPI的體系展現出更好的黏彈性。線性黏彈區的擴大，說明凝膠體系彈性的提升，展現了更多液體的特征，這可能與凝膠的吸水性有關。

圖3 不同樣品的應變掃描（A）、頻率掃描（B）和蠕變-回復（C）Fig.3 Strain sweep curves (A),frequency sweep curves (B) and creeprecovery curves (C) of different gel samples

由圖3B可知，頻率為10 Hz之前，隨著頻率的增加，4 組凝膠的G′、G″變化幅度不大，說明凝膠結構具有一定強度，不容易受機械力作用產生形變，并且共熱處理組凝膠的強度最大[26]。由圖3C計算可知，4 組樣品的蠕變-回復率分別為80.9%（CA組）、68.0%（CA-WPI組）、59.9%（CA-熱WPI組）、75.9%（共熱CA-WPI組）。綜合應變掃描結果可知，應變0.1%時，共熱CAWPI組和CA組應變掃描的G′、G″值大并且擁有更好的形變恢復能力，CA-WPI組和CA-熱WPI組應變掃描的G′、G″值小并且形變恢復能力較差[27]。綜合頻率掃描結果可知，應變0.1%、頻率1～10 Hz時，相比于單一海藻酸鹽體系，共熱處理海藻酸鈉和添加WPI會使體系模量值上升。

2.4 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的機械性質分析

由圖4可知，不同組間硬度存在顯著差異，CA組＞共熱CA-WPI組＞CA-WPI組＞CA-熱WPI組，這與蠕變-回復率結果一致。CA組硬度最大的原因可能是由于單一海藻酸鈉聚合物分子間的氫鍵能更好增加凝膠結構的剛性[28]；結合之前持水力的結果，CA組持水力較差，因此在單軸壓縮過程中，水分受擠壓流失，凝膠結構更加致密，進一步增強了其硬度。有研究表明，當多糖與高濃度乳清蛋白混合時，凝膠將出現由多糖凝膠網絡向蛋白質連續網絡的轉變，凝膠不再是自支撐的，導致凝膠硬度下降[29]。此外，由圖4可知，共熱CA-WPI組黏度明顯高于其余3 組，結合2.1節的微觀結構可知，共熱后體系中的蛋白呈現密集的球狀聚集體并且彼此連接，凝膠與探頭的接觸面增大，這可能是共熱CA-WPI組具有較強凝膠黏度的原因。

圖4 不同樣品的機械性質Fig.4 Mechanical parameters of different gel samples

應力松弛實驗通過給予凝膠恒定形變使其彈性應變轉化為塑性應變。由圖5可知，CA組和共熱CA-WPI組受力后產生彈性應變最大，并且下降幅度高，而CA-WPI組和CA-熱WPI組產生的彈性應小，下降幅度低。初始應力排序為CA組＞共熱CA-WPI組＞CA-WPI組＞CA-熱WPI組，這與硬度實驗結果一致。

圖5 不同樣品的應力松弛特征Fig.5 Stress relaxation characteristics of different gel samples

2.5 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的紅外光譜分析

由圖6可知，花色苷中2-苯基苯并吡喃的C＝C的伸縮振動峰出現在1600 cm-1附近，環上C—H的彎曲振動峰出現在1030 cm-1附近[30]，環上—OH的伸縮振動峰出現在3300 cm-1附近[31]，在1600～1700 cm-1沒有發現明顯的苯并吡喃C＝O振動吸收峰[32]，可能是被海藻酸鈉的化學鍵所掩蓋。整體上，花色苷的特征峰明顯，說明包埋效果良好[33]。據峰值出現位置可以發現，4 種包埋方式都能有效包埋花色苷。3 組復配凝膠組除了由于混合引起的峰位移和相對強度的改變，峰值趨勢相近，說明凝膠混溶交聯過程對化學鍵影響較小，物質之間多以非共價鍵形式結合。

圖6 不同樣品的紅外光譜Fig.6 FTIR spectra of different gel samples

2.6 海藻酸鈣-WPI復配凝膠的貯存穩定性分析

由圖7A可知，各組花色苷保留率的變化趨勢近似線性。其中，CA-熱WPI組的花色苷貯存穩定性最高，15 d后花色苷保留率為85.01%，其次是共熱CA-WPI組，保留率為67.47%，CA組和CA-WPI組的貯存穩定性變化趨勢相近，15 d后的花色苷保留率低于50%。由圖7B可知，4 ℃花色苷保留率各組的變化趨勢與25 ℃時相似，由于花色苷穩定性受溫度影響較大，低溫更有利于花色苷貯存，4 ℃花色苷損失速率更低，15 d后各組花色苷保留率均在50%以上。一方面，花色苷屬于水溶性色素，凝膠體系對花色苷的保留率與凝膠持水力相關；結合持水力結果可知，持水力越強的凝膠的花色苷保留率越大。另一方面，花色苷還可以和蛋白質中多肽鏈的C、N和O通過氫鍵結合[34]，進一步提高包埋的穩定性。

圖7 25 ℃（A）和4 ℃（B）貯藏過程中各組樣品的花色苷保留率Fig.7 Retention rates of anthocyanins embedded in different gel samples during storage at 25 (A) and 4 ℃ (B)

3 結論

從微觀結構、持水能力、流變學特性和機械性質以及包埋效果等多方面探究了不同處理方式對海藻酸鈣-WPI復配凝膠的性能差異。結果表明：相比于單一海藻酸鹽體系，添加WPI后體系的網絡結構表面粗糙度顯著增加，其中共熱CA-WPI組中的球狀蛋白質聚集體能夠均勻分布。復配熱處理后WPI能提升凝膠的持水能力，其中CA-熱WPI組展現出最佳的持水能力，在室溫下脫水收縮率僅6.94%，凍融后持水力達58.15%。流變學特性方面，各實驗組的線性黏彈區范圍均增大；應變0.1%時，共熱CA-WPI組體系模量和蠕變-回復率均優于對照組。機械性質方面，共熱CA-WPI組黏度最高，達0.68 mJ。紅外光譜結果顯示，復配凝膠中花色苷的特征峰明顯，包埋對花色苷的化學性質影響較小。在花色苷貯存穩定性方面，CA-熱WPI組展現出最好的花色苷保留率，25 ℃貯存15 d后花色苷僅損失14.99%。

本實驗探索了多糖蛋白復配凝膠體系的物化性質以及對生物活性物的包埋能力。但WPI和海藻酸鈉在混合以及成膠過程中發生的具體變化和相互作用機理還有待進一步實驗探究，以期將其更好地應用在實際食品產業生產中。