基于生物信息學(xué)方法分析FAM20A在甲狀腺癌中的診斷價(jià)值

吳南楠 尹瑞梨 孫榮欣 趙冬

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的腫瘤之一,且發(fā)病率正迅速增加[1]。來自美國的一項(xiàng)研究顯示晚期甲狀腺癌的診斷有所增加,與總死亡率的緩慢增長相一致[2],故甲狀腺癌的早期診治對(duì)預(yù)后影響至關(guān)重要。積極探索甲狀腺癌新的生物標(biāo)志物是推動(dòng)早期診斷和開發(fā)新的治療策略的方法之一。目前關(guān)于甲狀腺癌的具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚,序列相似性20家族成員A(Family with sequence similarity 20 member A,FAM20A),作為一種分泌蛋白,已經(jīng)被報(bào)道參與肝癌、甲狀旁腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-5],但其在甲狀腺癌中的表達(dá)及與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展目前仍不明確。本研究利用TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫,聯(lián)合臨床樣本,探索FAM20A在甲狀腺癌中的表達(dá)及臨床診斷意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(http://tcgadata.nci.nih.gov/),獲取甲狀腺癌相關(guān)數(shù)據(jù),包括甲狀腺癌組織樣本512例,正常甲狀腺組織樣本59例,整理TCGA-THCA(甲狀腺癌)項(xiàng)目STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù)并提取TPM格式的數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。通過甲狀腺癌組織樣本(n=59)配對(duì)正常組織樣本(n=59)分析FAM20A mRNA表達(dá)。另外,對(duì)512例甲狀腺癌組織樣本通過R 3.6.3軟件整理基因表達(dá)數(shù)據(jù),以FAM20A mRNA表達(dá)量中位值為界,分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。數(shù)據(jù)過濾策略:去除無臨床信息;數(shù)據(jù)處理方法:log2(value+1)。提取對(duì)應(yīng)編號(hào)配對(duì)的癌旁和癌樣本進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。搜索GEO數(shù)據(jù)庫,GSE205733檢測平臺(tái)為Illumina HiSeq 4000,包括正常甲狀腺組織4例,甲狀腺癌4例。應(yīng)用R(3.6.3版本)軟件包處理下載的文件,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)化和log2變換。收集2022年3月—2023年2月期間于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺結(jié)節(jié)手術(shù)治療且知情同意該項(xiàng)目的29例患者病理組織樣本,其中包括17例甲狀腺癌(實(shí)驗(yàn)組),12例良性甲狀腺結(jié)節(jié)(對(duì)照組)。本研究得到了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),批號(hào):2023-LHKY-045-02。

1.2 GSEA富集分析

GSEA用來評(píng)估一個(gè)預(yù)先定義的基因集的基因在與表型相關(guān)度排序的基因表中的分布趨勢(shì),從而判斷其對(duì)表型的貢獻(xiàn)。根據(jù)GSE205733數(shù)據(jù)集篩選出的正常甲狀腺組和甲狀腺癌組,根據(jù)基因風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)分,并與KEGG的基因集進(jìn)行比對(duì),對(duì)影響甲狀腺癌的可能的作用機(jī)制進(jìn)行探索。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用免疫組化試劑盒(KIT-9710,邁新試劑),首先將石蠟切片置于60℃烤箱中烤片3 h,二甲苯脫蠟入水后,加入檸檬酸抗原修復(fù)液中進(jìn)行熱修復(fù),使用內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫靜置孵育10 min,PBS洗3次,每次3 min;滴加非特異性染色阻劑或阻斷劑封閉液室溫孵育20 min,FAM20A多克隆抗體(25258-1-AP,Affinity)按照1∶200稀釋,直接滴加到組織上,4℃冰箱孵育過夜;次日,PBS洗3次,每次3 min,滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫孵育10 min;PBS洗3次,每次3 min;滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶,PBS洗3次,每次3 min。室溫下用顯色劑DAB(PR30010,Proteintech)顯色2 min后用自來水沖洗1 min;蘇木素復(fù)染,梯度乙醇脫水入二甲苯,封片。使用奧林巴斯顯微鏡拍攝圖像。采用Image J軟件評(píng)估染色區(qū)域的面積百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R 3.6.3軟件、Image J軟件和GraphPad Prism 9.5軟件繪圖,計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)(百分?jǐn)?shù))表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);兩獨(dú)立樣本計(jì)量資料,符合正態(tài)分布采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。甲狀腺癌組和正常甲狀腺組的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FAM20A在甲狀腺癌和正常甲狀腺組織中的表達(dá)

TCGA數(shù)據(jù)庫獲得FAM20A在512例甲狀腺癌組織和59例正常甲狀腺組織中的表達(dá)數(shù)據(jù),結(jié)果顯示,與正常甲狀腺組織相比,FAM20A表達(dá)在甲狀腺癌中顯著升高(P<0.001)(圖1A);配對(duì)分析結(jié)果顯示FAM20A在甲狀腺癌中顯著升高(P<0.001)(圖1B)。

圖1 甲狀腺癌組織和正常組織中的FAM20A的表達(dá)水平及配對(duì)分析Figure 1 The expression of FAM20A in TC and normal tissuesNote:***P<0.001,when compared with the normal group.

利用GSE205733數(shù)據(jù)集,根據(jù)表達(dá)譜芯片信息提供的FAM20A mRNA表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示甲狀腺癌組織中FAM20A表達(dá)明顯高于正常甲狀腺組織(P<0.001)(圖2)。

圖2 FAM20A在正常甲狀腺組織和甲狀腺癌組織中的表達(dá)差異Figure 2 The expression differences of FAM20A in TC and normal tissues Note:**P<0.01,when compared with the normal group.

2.2 FAM20A的差異表達(dá)與患者臨床特征之間的關(guān)系

根據(jù)FAM20A表達(dá)量中位值,將甲狀腺癌患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,比較兩組患者的臨床特征。結(jié)果顯示,兩組病理T分期、N分期和病理類型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。這些結(jié)果提示,FAM20A與臨床病例T分期、N分期和病理類型相關(guān)。

表1 甲狀腺癌患者FAM20A高表達(dá)組和低表達(dá)組臨床特征比較[n(%)]

2.3 FAM20A對(duì)甲狀腺癌的診斷價(jià)值

利用TCGA數(shù)據(jù)集,ROC曲線分析結(jié)果顯示,FAM20A表達(dá)對(duì)甲狀腺癌具有較高的診斷價(jià)值(AUC=0.828,P<0.05)(圖3)。

圖3 FAM20A在甲狀腺癌的ROC曲線分析Figure 3 The ROC curve of FAM20A in TC

2.4 GSE205733富集分析及FAM20A的相互作用蛋白

根據(jù)GSE205733數(shù)據(jù)集中篩選出的包括FAM20A的所有差異基因進(jìn)行GSEA分析,結(jié)果顯示以下信號(hào)通路參與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展,其中包括細(xì)胞周期有絲分裂、嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、通過白介素傳遞信號(hào)白介素4和白介素13信號(hào)、細(xì)胞通訊、P53下游通路、細(xì)胞連接組織、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲狀腺素生物合成等(圖4A)。STRING數(shù)據(jù)庫的結(jié)果分析顯示,10個(gè)與FAM20A相互作用的蛋白分別有PEAK1、FAM198A、FJX1、FAM198B、FAM20C、FAM83H、SGK223、AMBN、ENAM、WDR72(圖4B)。

圖4 GSEA分析以及FAM20A的相互作用蛋白Figure 4 GSEA analysis and interacting proteins of FAM20A

2.5 甲狀腺癌與良性甲狀腺結(jié)節(jié)組織FAM20A免疫組化染色結(jié)果

17例甲狀腺癌和12例良性甲狀腺結(jié)節(jié)對(duì)照組織進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果顯示與良性甲狀腺結(jié)節(jié)組相比,FAM20A在甲狀腺癌中的表達(dá)顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖5)。

圖5 FAM20A在甲狀腺癌和良性甲狀腺結(jié)節(jié)中的免疫組化染色及陽性面積統(tǒng)計(jì)分析Figure 5 Immunohistochemical staining and statistical analysis of FAM20A positive area in TC and benign thyroid nodules Note:**P<0.01,when compared with benign thyroid nodules.

3 討論

根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì),全球每年發(fā)生58.6萬例甲狀腺癌,且發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[6-7]。甲狀腺癌目前通過超聲及針吸活檢診斷,然而,甲狀腺活檢在細(xì)胞學(xué)上不確定的比例高達(dá)25%[8]。故對(duì)甲狀腺活檢結(jié)果不確定的患者積極進(jìn)行分子標(biāo)記物評(píng)估可協(xié)助明確甲狀腺癌的風(fēng)險(xiǎn)和管理策略[9]。探索甲狀腺癌關(guān)鍵分子標(biāo)志物有助于早期診斷、預(yù)后評(píng)估和復(fù)發(fā)監(jiān)測,降低侵入性手術(shù)帶來的危害。FAM20A蛋白最初是從造血細(xì)胞中鑒定出來的,目前被報(bào)道參與肝癌、甲狀旁腺癌的發(fā)生發(fā)展[3-5]。但關(guān)于FAM20A是否參與甲狀腺癌的發(fā)生目前仍不明確。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FAM20A在甲狀腺癌中顯著升高,且ROC曲線分析結(jié)果提示FAM20A對(duì)甲狀腺癌具有較高的診斷價(jià)值。為了進(jìn)一步探索甲狀腺癌組織中FAM20A表達(dá)的差異,對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫GSE205733數(shù)據(jù)集信息分析結(jié)果提示甲狀腺癌組織中FAM20A表達(dá)高于正常甲狀腺組織樣本。最后,通過甲狀腺癌及良性甲狀腺結(jié)節(jié)組織臨床樣本進(jìn)行免疫組化染色,也證實(shí)FAM20A在甲狀腺癌中的高表達(dá)。本研究結(jié)果提示FAM20A可作為診斷甲狀腺癌的潛在分子標(biāo)記物。

FAM20A屬于FAM20家族之一,FAM20A最早是在牙釉質(zhì)發(fā)育不全的疾病中被鑒定出來的,是一種假激酶[3],通過非催化機(jī)制的信號(hào)傳遞發(fā)揮功能[10]。假激酶的突變和表達(dá)失調(diào)與很多疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān),如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病和自身免疫性疾病等[10-11]。另外,FAM20A是一種分泌蛋白[12],能夠釋放到血液循環(huán)中在生理、病理系統(tǒng)中起著重要作用。我們對(duì)包含F(xiàn)AM20A等的差異基因進(jìn)行GSEA富集分析,結(jié)果顯示主要富集在細(xì)胞周期有絲分裂、嗜中性粒細(xì)胞脫顆粒、通過白介素傳遞信號(hào)白介素4和白介素13信號(hào)、細(xì)胞通訊、P53下游通路、細(xì)胞連接組織、非整合素膜Ecm相互作用、Tap63通路、甲狀腺素生物合成等通路上。目前研究提示多種惡性腫瘤發(fā)生過程與p53信號(hào)通路的失調(diào)基因相關(guān)[13-15],p53信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),具有多種不同的輸入和下游輸出,與其作為腫瘤抑制通路的作用相關(guān),p53發(fā)揮作用的生物學(xué)過程是參與細(xì)胞周期阻滯、衰老、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡[16]。這提示今后研究中進(jìn)一步深入探索FAM20A是否通過p53信號(hào)通路調(diào)控甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述,FAM20A有望成為甲狀腺癌的一種新的診斷性生物標(biāo)志物,且FAM20A可能成為潛在的治療靶點(diǎn)。鑒于FAM20A是一種分泌蛋白[12],在今后的研究中,將進(jìn)一步探索FAM20A在血液循環(huán)中的表達(dá)水平,評(píng)估其對(duì)診斷、治療的價(jià)值,為甲狀腺癌診療提供新的分子機(jī)制。