基于原噬菌體類型的廣西柑橘黃龍病菌種群分析

李戰(zhàn)彪　林林　陳錦清等

關(guān)鍵詞 廣西；柑橘；柑橘黃龍病；原噬菌體；種群類型

中圖分類號：S 436.66 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022200

柑橘黃龍病（citrus Huanglongbing，HLB）是柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1]。該病由專性寄生的柑橘韌皮部桿菌屬Candidatus Liberibacter引起，目前發(fā)現(xiàn)有3個種，分別為亞洲種Candidatus Liberibacter asiaticus（CLas）、非洲種Candidatus Liberibacter africanus（CLaf）和美洲種Candidatus Liberibacter america-nus （CLam）[1-2]，危害我國柑橘的主要為CLas。在我國HLB最早于20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)于廣東省，至今我國的大多數(shù)柑橘產(chǎn)區(qū)都受到該病的危害，且部分地區(qū)受害嚴(yán)重[1，3-6]。廣西是我國重要的柑橘產(chǎn)區(qū)，柑橘種植面積和產(chǎn)量均居全國前列，黃龍病的肆虐嚴(yán)重制約產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。明確黃龍病在廣西的發(fā)生、分布并分析黃龍病菌種群類型，對掌握該病的蔓延流行及防控有重要意義。

針對CLas種群多樣性的研究大多基于保守的16S rDNA序列、16S/23S rRNA基因間隔區(qū)、β操縱子以及外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）基因等染色體區(qū)域[7-9]。Subandiyah等[9]通過16S rDNA、16S/23S rDNA間隔區(qū)對亞洲多個地區(qū)的黃龍病菌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)其基因變異較小，多樣性不顯著；謝昌平等[7]對贛南柑橘黃龍病菌的16SrDNA、16S/23S rDNA間隔區(qū)和核糖體蛋白基因的遺傳多樣性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，供試的黃龍病菌樣品在3個基因片段上的RFLP指紋圖譜均一致，未表現(xiàn)出多態(tài)性[7]；黃永輝等[10]OMP基因?qū)V東不同地區(qū)的柑橘黃龍病菌遺傳多樣性進(jìn)行分析未發(fā)現(xiàn)顯著差異。Puttamuk等[11]利用2個效應(yīng)因子基因（LasA和LasA）對泰國的柑橘黃龍病菌進(jìn)行多樣性分析發(fā)現(xiàn)，LasAn基因的突變率較小。相對于保守的染色體區(qū)域，原噬菌體區(qū)域由于是噬菌體整合到細(xì)菌宿主基因組的DNA片段，具有較高的隨機(jī)性和變異率，更適于研究CLas種群遺傳結(jié)構(gòu)多樣性。Tomimura等[12]對東南亞各國不同寄主、不同來源的柑橘黃龍病菌的變異水平研究后發(fā)現(xiàn)，相比16S rDNA、16S/23S rDNA間隔區(qū)，原噬菌體DNA聚合酶基因更能區(qū)分不同國家CLas間的差異；Liu等[13]則通過原噬菌體末端酶基因?qū)ξ覈颇虾蛷V東的HLB樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩省樣品中的原噬菌體末端酶基因檢出率存在差異；Zhou等[14]利用2個原噬菌體超變異基因?qū)Σ煌貐^(qū)、不同品種的CLas進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株在該基因上具有高度多態(tài)性；黃洪霞等[15]利用原噬菌體區(qū)域和短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）對采自廣東省的176個黃龍病樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果表明基于不同位點(diǎn)和基于所有位點(diǎn)所得到的聚類不同；Fu等[16]對我國南方9省的CLas的原噬菌體類型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，南方9省的CLas可根據(jù)海拔位置分為兩個組群，高海拔的PTG1和低海拔的PTG2，而PTG2又進(jìn)一步分為PTG2-1和PTG2-2，廣西的菌群位于PTG2-2：Zheng等[17]利用原噬菌體、短串聯(lián)重復(fù)序列和微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件（miniature in-verted-repeat transposable elements， MITEs）對我國南方9省的667份CLas分析后發(fā)現(xiàn)，不同基因位點(diǎn)呈現(xiàn)的CLas的遺傳多樣性存在差異。目前，已鑒定到3種類型的原噬菌體type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2， NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963），且不同的CLas菌株可能攜帶不同類型或組合的原噬菌體[18-21]。

廣西地處熱帶亞熱帶地區(qū)，氣候適宜柑橘類作物生產(chǎn)，也是黃龍病發(fā)生較為嚴(yán)重的地區(qū)；針對廣西柑橘黃龍病的研究多集中在某一品種[22]或不同品種間[23]的黃龍病發(fā)病率及16S rDNA的分析上，較少有系統(tǒng)研究其種群的報道。近些年，隨著柑橘產(chǎn)業(yè)迅速擴(kuò)張，黃龍病、病毒病等病害呈高發(fā)趨勢，研究病原菌的種群分化有助于了解病害的發(fā)生與流行，進(jìn)而制定更為有效的防控措施。本研究從廣西各地市柑橘種植區(qū)采集疑似柑橘黃龍病樣品，并對樣品進(jìn)行黃龍病菌和原噬菌體類型的PCR檢測，明確HLB在廣西的發(fā)生分布及黃龍病菌的種群類型，研究結(jié)果將為該病的防控提供理論支撐。

1材料與方法

1.1柑橘葉片樣品采集

2016年-2021年，從廣西壯族自治區(qū)南寧市、柳州市、百色市、梧州市等14個地級市的柑橘種植區(qū)，采集‘沃柑’‘砂糖橘’‘沙田柚’‘臍橙’‘貢柑’‘黃金柑’‘茂谷柑’‘皇帝柑’‘三紅蜜柚’‘脆蜜金橘’‘泰國紅寶石青柚’‘越南青柚’等品種疑似黃龍病葉片樣品3 293份，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 DNA提取

取葉片樣品100 mg，用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]抽提葉片總DNA。具體操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。最后將DNA沉淀溶解于50μL ddHO中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3黃龍病菌的PCR檢測

黃龍病菌的PCR檢測引物參考Hocquellet等[24]報道的基于β操縱子基因設(shè)計的檢測引物（表1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。反應(yīng)體系如下（總體積20μL）：DNA1μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMasterMix（Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）10μL，ddH20 8μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min;95℃30 s，540C 30 s.72℃30 s，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4基于原噬菌體類型的黃龍病菌檢測

黃龍病菌分型引物參考Zheng等[25-26]（表1），引物序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。選取2021年P(guān)CR檢測為陽性的柑橘葉片總DNA為模板，反應(yīng)體系如下（總體積10μL）：DNA0.5μL，10μmol／L上、下游引物各0.5μL，2×TaqMaster Mix （Dye）（康為世紀(jì)生物科技有限公司）5μL，ddHO 3.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃ 5 min;95℃30 s，54℃45 s，72℃45 s，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

2.1柑橘樣品的PCR檢測

利用黃龍病菌特異檢測引物對所采集的葉片總DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所采集的3293份柑橘葉片樣品中有856份樣品可擴(kuò)增出一條大小約為703 bp的目的條帶（圖1），而健康柑橘樣品對照和清水對照則無相應(yīng)擴(kuò)增，陽性樣品檢出率為25. 99%。分別對每年、每個地市樣品的檢出率進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)廣西壯族自治區(qū)內(nèi)的14個地市均有黃龍病發(fā)生，其中，691份樣品采集自南寧市，黃龍病陽性樣品的檢出率為33.29%；同時，通過對2016年一2021年每年的樣品檢出率進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，自2016年起，廣西各地市黃龍病的檢出率呈上升趨勢（表2）。

2.2廣西柑橘黃龍病菌攜帶的原噬菌體類型

本研究利用Zheng等[24-25]報道的引物對2021年采集的268份陽性柑橘樣品進(jìn)行了檢測，從部分樣品中可分別或同時擴(kuò)增出type 1（目的條帶分別為975 bp和866 bp）、type 2（目的條帶分別為813 bp和918 bp）、type 3（目的條帶分別為950 bp和884 bp）等3種類型的目的PCR條帶（圖2）。

統(tǒng)計檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在268份樣品中，67.91%的樣品僅能擴(kuò)增出1種噬菌體類型的目的條帶，5.97%的樣品可同時擴(kuò)增出2種或2種以上噬菌體類型的目的條帶，部分樣品未能擴(kuò)增出任何噬菌體類型的目的條帶。共計存在7種類型的黃龍病菌種群（表3），即僅有type 1菌株，僅有type 2菌株，僅有type 3菌株，type 1+type 2復(fù)合菌株，type 2+type 3復(fù)合菌株，type 1+type 2+type 3復(fù)合菌株，未檢出任何類型菌株（none type）；而在這些僅能擴(kuò)增出一種噬菌體類型的樣品中，170份樣品能擴(kuò)增出type 2，表明type 2是廣西的優(yōu)勢種群；僅含有type 1和僅含有type 3的菌群只在南寧市發(fā)現(xiàn)；復(fù)合菌群主要以type 1+type 2（3個），type 2+type 3（2個），type 1+type 2+type 3（11個）3種組合存在，本研究未檢測到type 1+type 3類型組合的菌群。其中，南寧市的CLas種群類型最為豐富（表3）。

3結(jié)論與討論

近年來，隨著我國柑橘產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展，廣西柑橘種植面積和產(chǎn)量居全國之首，柑橘黃龍病給柑橘產(chǎn)業(yè)帶來了極大威脅。本研究利用常規(guī)PCR對從廣西各地級市采集的3293份柑橘（柚類）樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有856份樣品感染了柑橘黃龍病，陽性樣品檢出率為25.99%，通過對各市陽性樣品進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，各地市的柑橘樣品均能檢出柑橘黃龍病；而通過對不同年份的黃龍病檢出率進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，2016年—2021年，黃龍病菌的檢出率從12.16%逐步上升至46.94%，研究結(jié)果顯示，柑橘黃龍病在廣西的發(fā)生有加重的趨勢，防控形勢不容樂觀。

原噬菌體區(qū)域具有較高的隨機(jī)性和變異率，適于研究CLas種群遺傳結(jié)構(gòu)多樣性，目前，已鑒定到3種類型的原噬菌體type l（SC1，NC_019549）、type 2（SC2，NC_019550）和type 3（P-JXGC-3，KY661963）[19，27]。在我國，存在多種類型的原噬菌體CLas菌株，陳麗芬等[28]在贛南地區(qū)的柑橘木虱Diaphorina citri Kuwayama體內(nèi)發(fā)現(xiàn)4種組合的原噬菌體類型菌株，且單一類型的菌株檢出率較高；李嘉慧等[21]在我國南方8省區(qū)發(fā)現(xiàn)7種組合的原噬菌體菌株，type 2類型的檢出率最高，是華南地區(qū)CLas的優(yōu)勢菌株；崔一平等[20]對廣東梅州柑橘主產(chǎn)區(qū)CLas的噬菌體類型研究發(fā)現(xiàn)，梅州柑橘主產(chǎn)區(qū)的CLas大部分含有SC2-1。本研究利用3種類型的原噬菌體分類的特異性引物對廣西壯族自治區(qū)內(nèi)CLas的種群類型進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，廣西區(qū)內(nèi)存在7種類型的CLas菌株，其中，type 2類型的菌株檢出率達(dá)63.06%，是廣西的優(yōu)勢菌株，該結(jié)果與李嘉慧等[21]的部分研究結(jié)果一致；不同的是，本研究還發(fā)現(xiàn)了type 1、type 2+type 3和type 1+type2等3種類型的菌株，但并未發(fā)現(xiàn)李嘉慧等報道的type 1+type 3菌株，這可能跟采樣地點(diǎn)不同有關(guān)。另外，值得注意的是，本研究有較大比例（26.49%）的黃龍病陽性樣品中未檢出任何類型（none type）的原噬菌體菌株，是位點(diǎn)發(fā)生變異還是存在其他類型的原噬菌體菌株，值得深入研究。

基因交流和選擇壓力是促進(jìn)種群進(jìn)化的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)廣西區(qū)內(nèi)CLas原噬菌體菌株類型多樣（7種類型）。近年來廣西柑橘產(chǎn)業(yè)的迅猛發(fā)展，新品種不斷引進(jìn)并大力推廣，區(qū)域間種苗調(diào)運(yùn)頻繁，而苗木帶菌則促進(jìn)了基因交流，不同品種間的選擇壓力促使種群進(jìn)化。本研究未能就不同地域間的不同品種上的CLas種群進(jìn)行研究，但崔一平等[20]研究認(rèn)為CLas的進(jìn)化與柑橘品種、小范圍內(nèi)的地域關(guān)系不大，但其也發(fā)現(xiàn)CLas菌株的進(jìn)化速度較快，在同一地域的同一果園內(nèi)存在不同的CLas株系。研究CLas在同一區(qū)域不同品種間的進(jìn)化有助于了解黃龍病的發(fā)生流行規(guī)律，相關(guān)研究仍待進(jìn)一步加強(qiáng)。

本研究通過6年的采樣鑒定發(fā)現(xiàn)，柑橘黃龍病已遍布廣西各地市，病菌種群結(jié)構(gòu)多樣，且類型較為復(fù)雜，黃龍病在廣西的種群進(jìn)化等還有待進(jìn)一步研究。