玉米禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病抗性鑒定接種方法的比較

張海東　董懷玉　王麗娟等

關鍵詞 玉米；禾谷鐮孢；莖腐病；穗腐病；抗性鑒定

中圖分類號：S 435.131.49 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2022196

玉米是我國主要的糧食和飼料作物，也是重要的工業原料和能源植物，自2012年以來，玉米播種面積超越水稻成為我國第一大糧食作物，在國民經濟和農業生產中占有重要地位，其生產的穩定性和安全性直接影響我國糧食作物的生產安全和延伸產業的健康發展。近年來隨著農業種植業結構調整和耕作栽培方式轉變、玉米品種更替以及全球性氣候變暖，玉米病蟲害發生呈持續加重趨勢，已成為制約玉米高產穩產的重要因素。特別是隨著全程機械化、秸稈還田、少免耕保護性耕作技術的推廣，玉米莖腐病、穗腐病等土傳病害已成為各玉米產區重大生產問題，也是治理和防控難點。據估測和統計，全球因病蟲害造成的玉米產量損失達19.5%～41.1%，控制玉米病蟲害對于保障玉米的安全生產具有十分重要的意義。而種植抗病或耐病品種是防控玉米莖腐病、穗腐病安全、經濟和有效的根本措施，篩選優異、穩定的抗性種質是成功選育抗、耐病玉米品種的基礎和必要手段[1-3]。育種與生產部門在進行玉米抗性種質鑒定過程中使用的鑒定評價方法各不相同，且抗性評價結果互有差異，尋找快速、準確、簡便的鑒定評價方法，是進行種質資源抗病性鑒定的首要問題[4-6]。引起玉米莖腐病、穗腐病的病原菌種類比較多，已報道的病原菌種類均有20余種，國內多數研究認為其致病菌主要為鐮刀菌，其中禾谷鐮孢Fusarium graminearum為優勢致病菌，侵染玉米不僅造成嚴重的產量損失，且侵染玉米籽粒后產生的真菌毒素可對人畜健康造成嚴重威脅[7-9]。為此，本文對收集的92份玉米種質分別采用不同的田間人工接種鑒定技術同步開展了玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性鑒定接種方法比較試驗，篩選適宜北方春玉米產區玉米禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病抗性鑒定的最佳接種方法及抗性種質，以期為促進抗病種質創新、抗病育種及生產上采取有效防病措施提供資源和依據。

1材料與方法

1.1材料

供試的玉米種質共92份，均由遼寧省農業科學院植物保護研究所提供并保存，其中外引種質51份，國內常規種質和自有改良創新種質41份。玉米禾谷鐮孢莖腐病對照種質為‘齊319’（抗病）和‘掖107'（感病），穗腐病對照品種為‘X178’（抗病）和‘B73’（感病）。

供試的玉米莖腐病和穗腐病病原禾谷鐮孢菌株各1株，均由遼寧省農業科學院植物保護研究所采集遼寧玉米產區田間玉米莖腐病、穗腐病病害樣本經單孢分離、純化培養而獲得的純培養物，經致病力測定篩選的強致病力菌株。

1.2方法

1.2.1接種物制備

1.2.1.1莖腐病接種物繁殖

1）菌土覆蓋法和傷根法：將供試玉米莖腐病病原禾谷鐮孢菌株接種于滅菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培養5～7d，待菌絲布滿PDA表面時，轉移接種于高壓滅菌的玉米粒培養基上（玉米粒浸泡24 h以上，煮th，涼后濾水裝入耐高溫高壓塑料袋中封口于121℃高壓滅菌th，冷卻備用），于生化培養箱中25℃黑暗培養擴繁，待菌絲布滿玉米粒后即可用于接種。

2）莖節注射法：將供試菌株接種于滅菌的PDA平板上，于25℃下黑暗培養5～7d，待菌絲布滿PDA表面時，按每10皿培養物兌水700mL的比例，勻漿成糊狀，用于注射接種。

1.2.1.2穗腐病接種物繁殖

1）花絲通道法：將供試玉米穗腐病病原禾谷鐮孢菌株接種于高壓滅菌的SN低營養液體培養基（KHPO 1g，KCl 0.5g，KNO 1g，MgSO*7HO0.5g，葡萄糖0.2g，蔗糖0.2g，加蒸餾水補足至11）中，于25℃下黑暗振蕩培養7～14d，可產生大量大型分生孢子，將培養液經雙層滅菌紗布過濾，孢子懸浮液濃度調至2×10個/mL，即可用于接種。

2）雙牙簽法：將供試菌株接種于PDA平板上，于25℃下黑暗培養擴繁4～5d，備用；選用木質牙簽，水煮2～3次，每次煮th，煮后用清水沖洗2～3次，晾至半干后將牙簽用硫酸紙包好，高壓滅菌30 min，晾涼后平鋪于準備好的PDA平板上，將擴繁的病原菌接入鋪好牙簽的培養基四周，25℃下黑暗培養，使病原菌從培養基向牙簽上蔓延生長，經10～14d，當牙簽被病原菌覆蓋后，即可用于田間玉米接種。

1.2.2接種鑒定方法

病害鑒定圃設于遼寧省農業科學院實驗基地內。5月上旬播種，田間順序排列，每份種質種植10行，行長5m，行距0.6 m，行留苗25株左右。每種人工接種鑒定方法接種2行，2次重復。

1.2.2.1莖腐病接種方法

1）菌土覆蓋法：田間接種與播種同步進行，在供試材料播種前3～5 d，將擴繁的玉米粒培養基接種物與過篩潮濕田園土按照1：4比例（質量比）充分混拌制備成濃度為20%的菌土，覆膜保存備用。播種時采用穴播法播種玉米，先播種玉米種子，后將制備的菌土100g／穴覆蓋在玉米種子上覆土、鎮壓。

2）傷根法：在玉米抽雄初期進行，將玉米根系一側土壤扒開，將病原菌培養物20～30g撒在露出的根系處并覆土。接種后及時進行一次田間澆水，保證病原菌侵染需要的土壤濕度條件。

3）莖節注射法：在玉米植株散粉后3～5 d進行，在植株靠近地表的第2莖節中部，用電鉆以45度角斜向下打孔至莖髓部，利用注射器將1.0 mL制備的接種菌液直接注入玉米植株莖髓中，用凡士林封洞。接種后田間澆水1次，此后進行正常肥水管理。

1.2.2.2穗腐病接種方法

1）花絲通道法：在玉米果穗吐絲授粉3～5 d后，利用注射器，從果穗花絲部位將制備好的孢子懸浮液注入果穗，每穗注射接種2 mL。接種后正常肥水管理。

2）雙牙簽法：在玉米果穗吐絲后14～21 d，花絲已完全萎蔫為接種適期。選擇適宜接種果穗，先在果穗中部用大號注射針頭穿洞，深度達果穗穗軸中心為宜，防止直接用牙簽插入時附著在牙簽上的病原菌脫落，然后將帶菌牙簽2根并排插入果穗接孔中。接種后正常肥水管理。

1.2.3抗性評價方法

田間抗性評價均于9月中旬玉米進入乳熟后期進行。

玉米禾谷鐮孢莖腐病莖節注射法調查時，先砍除莖稈上部節段，留地上莖4～5節，用快刀縱剖莖稈，從縱剖面查看莖稈中莖髓部變色的病斑區域大小。逐株調查莖髓部發病面積，記載病情級別（表1），計算平均病情級別并依據其確定供試種質對玉米莖腐病的抗性水平，抗性評價標準見表2[10]。傷根法和菌土覆蓋法調查時逐株調查每份鑒定種質的發病狀況。剝開近地面玉米葉片，著重調查莖基部節位，莖節或節間變褐色或黑褐色，莖節變軟，剖開髓部可見髓部空松，顏色變深，即為發病株。調查記載總株數和發病株數，計算發病株率，以群體發病率確定其對玉米莖腐病的抗性水平，抗性評價標準見表2[11]。

玉米禾谷鐮孢穗腐病調查時將接種玉米果穗剝去苞葉，逐個調查記載果穗病情級別：1級：發病面積占果穗總面積0%～1%；3級：發病面積占果穗總面積2%～10%；5級：發病面積占果穗總面積11%～25%；7級：發病面積占果穗總面積26%～50%；9級：發病面積占果穗總面積51%～100%。計算平均病情級別，確定供試種質對玉米穗腐病的抗性水平，抗性評價標準見表2[12-13]。

2結果與分析

2.1莖腐病3種接種鑒定方法的抗性評價結果比較

統計分析玉米禾谷鐮孢莖腐病3種接種鑒定方法的抗性評價結果（圖1）可知：3種接種方法的發病（發病率或病情級別）嚴重度依次為莖節注射法>菌土覆蓋法>傷根法，鑒定評價表現中抗以上的抗性種質材料分別為20份、56份和67份，占供試玉米種質總數的21.74%、60.87%和72.83%；其中莖節注射法鑒定出的抗性種質以中抗為主，未見表現高抗的材料；而菌土覆蓋法和傷根法鑒定出的抗性種質均以高抗為主，中抗次之，表現抗性的材料極少或沒有，表明莖節注射法可更好地鑒定出抗莖腐病的玉米種質，其次為菌土覆蓋法。

2.2穗腐病2種接種鑒定方法的抗性評價結果比較

從玉米禾谷鐮孢穗腐病2種鑒定方法的抗性評價結果（圖2）可知，不同接種方法的發病嚴重度依次為雙牙簽法>花絲通道法，其中雙牙簽法鑒定中表現中抗及以上的抗性種質分別為2份（HR）、33份（R）和34份（MR），分別占供試種質的2.17%、35.87%和36.96%；花絲通道法鑒定中表現中抗及以上的抗性種質分別為2份（HR）、56份（R）和27份（MR），分別占供試種質的2.17%、60.87%和29.35%。表明雙牙簽法能更好地鑒定評價玉米種質對穗腐病的抗病性水平。

2.3抗性玉米種質鑒選

通過不同的接種方法對92份玉米種質進行了2種禾谷鐮孢病害的田間抗性鑒定，分別篩選出了一批抗性種質，但不同的接種鑒定方法篩選出的抗性種質有差異。

玉米穗腐病抗性鑒定中‘鐵0270’‘W240’‘9539‘CG109’和‘F1803’等66份材料在2種接種方法中均表現出穩定的抗性，占供試玉米種質的71.74%（表3）。

玉米莖腐病3種接種鑒定方法分別鑒選出的抗性種質（表4）中僅有‘鐵0203’‘鐵0255-1’‘F886’‘9502’‘9556’‘9578’‘LP4-1’‘NET165’‘W382'等9份材料在3種接種方法中均表現出穩定的抗性，只占供試玉米種質的9.78%；而菌土覆蓋法和傷根法分別鑒選出的抗性種質中有‘9407’‘W360’‘鐵0203’和‘N510’等52份材料在2種鑒定方法中均表現出穩定的抗性，占供試種質的56.52%。

菌土覆蓋法和傷根法鑒定篩選出的對莖腐病均表現穩定抗性的52份種質和穗腐病2種接種方法篩選出的表現穩定抗性的66份種質中，有33份種質兼抗禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病，占供試種質的35.87%（表5）。

3結論與討論

本研究通過田間人工接種試驗對92份玉米種質同步進行了禾谷鐮孢莖腐病和穗腐病不同接種鑒定方法的抗性評價與篩選，明確東北春玉米產區玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性鑒定的最佳接種方法。禾谷鐮孢莖腐病3種接種鑒定方法中莖節注射法鑒選出的抗性種質數量最少，原因可能是其人為機械損傷莖部韌皮組織后病菌在莖部髓組織內擴展，僅反映莖部髓組織致病菌擴展的情況，忽略了玉米植株莖稈韌皮組織的物理抗性水平所致[14]；而菌土覆蓋法和傷根法更接近田間自然侵染規律，鑒定評價出的抗性種質包含玉米植株莖稈韌皮組織的物理抗性，同時，綜合考慮接種鑒定技術的實用性和可操作性，采用菌土覆蓋法對大體量種質資源進行田間抗病性鑒定可能更具有優勢，而莖節注射法在精準鑒定中可更好地評價玉米種質的抗病性。禾谷鐮孢穗腐病2種接種鑒定方法中雙牙簽法在種質接種后發病的嚴重度、田間進行接種的可操作性和實用性方面均優于花絲通道法。本研究篩選出一批對2種病害表現抗性穩定的單抗或兼抗種質，這些抗性種質將對我國玉米抗病育種和豐富我國玉米禾谷鐮孢莖腐病、穗腐病抗性基因的遺傳基礎具有重要的利用價值[15-17]。

近年來，我國玉米耕作栽培措施有了很大的變革，密植栽培、秸稈還田、少免耕等保護性耕作栽培技術得到大力推廣應用。密植栽培在提高玉米產量的同時，也增加了玉米的抗性負擔，而秸稈還田和免耕技術與玉米病害之間的關系十分密切，秸稈覆蓋還田后會增加病菌基數，增加病害的發生概率，使玉米病害發生流行呈現多變性，尤其玉米莖腐病，穗腐病等土傳病害發生危害逐年加重，且生產上推廣的一些玉米品種對莖腐病、穗腐病抗性多在中抗水平及以下；即使是抗性品種，多年連作后也可導致病害的嚴重發生[18-19]。同時玉米因其植株高大，莖腐病、穗腐病等土傳病害多在生育后期呈現發病高峰，田間防控措施難以實施。由此導致以莖腐病、穗腐病為主的土傳病害成為當前和未來玉米病害發生的重點及治理、防控難點，必將成為各玉米產區的重大生產問題。田間病害發生情況調查表明，不同玉米品種或種質資源對莖腐病的抗性存在顯著差異，抗病品種具有明顯降低病害發生率、減輕產量損失的作用。對玉米生育后期的土傳病害的治理目前尚無有效單一的防控措施，綜合防治以推廣種植抗病品種為主，輔以農業防治、化學防治及生物防治等多項措施并舉的治理方案[20-22]，其中栽培玉米抗性品種占目前防治方式的43%[23]。優異的抗性種質是進行抗病品種選育的前提和基礎，適宜的接種鑒定方法則是挖掘抗性種質的必要手段。今后玉米莖腐病、穗腐病等土傳病害研究重點應搜集、挖掘和鑒定玉米種質資源，拓展抗性種質，加大其利用途徑，為抗病育種提供新的抗源；避免現有抗性種質資源比較豐富，而育種相對不足的狀況；將挖掘到的抗病基因，特別是多抗基因通過生物技術轉入到感病優異種質或品種中進行創新改良，為選育抗病品種奠定材料基礎[24]；篩選功能菌株研制生防制劑和采取農業綜合栽培措施等綠色防控技術。