實時熒光定量PCR技術在湖南油菜根腫病菌檢測中的應用

周游　謝芳玲　肖蓉等

關鍵詞 油菜根腫病；實時熒光定量PCR;休眠孢子；檢測

中圖分類號：S 432.44 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2022282油菜作為湖南省的主要油料作物，其種植面積居全國首位[1]。近年來，由于油菜根腫病的發生和蔓延，嚴重影響油菜的產量和品質，對湖南油菜產業構成重大威脅。油菜根腫病是由蕓薹根腫菌Plas-modiophora brassicae侵染并引起的一種破壞性土傳病害[2]。該病害主要由帶菌土壤中的休眠孢子傳播，休眠孢子可在沒有寄主植物的情況下在土壤中存活20年[3]。對休眠孢子的早期檢測有助于及時采取相應措施防止該病害進一步傳播，但蕓薹根腫菌作為專性寄生菌，不能人工培養，且傳統PCR檢測技術不能對初始模板準確定量分析，也無法避免污染時出現的假陽性[4]。而具有定量準確、特異性強、靈敏度高、操作簡便等優點的實時熒光定量PCR逐漸受到青睞和廣泛應用[5]。Wallenhammar等采用DNA提取和純化以及PCR分析，將探針和qPCR技術相結合建立了一種穩定而快速的用于檢測和定量田間土壤樣品中休眠孢子的方法[6]。Deo-ra等建立的多重TaqMan qPCR測定法提高了蕓薹屬植物土壤中休眠孢子的檢測靈敏度。將競爭性內部陽性對照（competitive internal positive control，CIPC）用于該測定法可以更準確地估計土壤中的休眠孢子，也減少了假陰性的可能性[7]。Li等開發了SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR方法檢測出土壤樣品中休眠孢子的檢測限為1000個/g，同時驗證了該方法具有高度特異性[8]。宋瓊等采用SYBR GreenI實時熒光定量PCR檢測體系對采集的42份土樣所含根腫病菌休眠孢子進行定量檢測，探索了土壤中根腫病菌數量與作物根腫病發病之間的關系[9]。

本文對2021年-2022年從湖南各地采集的64份油菜根腫病田塊土樣進行系統整理，并根據蕓薹根腫菌ITS序列設計一對特異性引物，應用qPCR技術檢測湖南各地土樣的休眠孢子數量，總結出休眠孢子數量對油菜田發病程度的影響，此方法可以作為精準檢測蕓薹根腫菌的技術指導，有助于防止該病害進一步傳播。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試病樣

含根腫病菌的樣品采自湖南省油菜種植區各鄉鎮油菜根腫病植株。將病株腫根洗凈后，編號并裝入密封袋，置－20℃冰箱中保存。

1.1.2供試土樣

分別采自湖南省懷化市、常德市、岳陽市、吉首市等各鄉鎮油菜種植區土樣共64份。采集土樣時，挖取距地表約5～10 cm的油菜病株根系及周圍土壤，對整塊油菜田采用隨機五點取樣法并將采集的土樣混合均勻。

1.2試驗方法

1.2.1土壤處理

將采集的土樣放置于陰涼處，風干后用研缽研磨，將磨碎的土樣過380μm孔徑的篩網后，裝入密封袋并編號，保存于－20℃冰箱。

1.2.2油菜腫根DNA提取

取少量洗凈、切碎的油菜腫根采用CTAB法提取總DNA[10]，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質量。

1.2.3特異性引物設計和PCR擴增

根據蕓薹根腫菌的ITS序列應用PrimerPremier 5.0軟件設計一對特異性引物pbF/pbR，由北京擎科生物技術有限公司合成。引物序列為pbF（5′-ACAACGATGAAGAACGCAGCGAACT-3′）和pbR（5′-CGCAAACAAACAGAAACCGA-CACTC-3′）。PCR反應體系（25μL）為：2×Mix12.5μL，PbF（10μmol／L）和PbR（10μmol／L）各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 9.5μL。擴增程序為：94℃預變性30s；98℃變性10s，60℃退火10s，72℃延伸15s，34個循環；72℃延伸2min。以ddH20為對照。擴增后進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4制備標準質粒

純化PCR產物，將純化產物與pMD18-T（TaKa-Ra）載體連接，轉化大腸桿菌感受態細胞Trelie 5α（北京擎科生物技術有限公司），取100、200μL菌液涂布到含有氨芐（50μg／mL）的LB固體培養基上，置于37℃恒溫培養箱倒置培養12～16 h。做菌落PCR，隨機挑取被鑒定為陽性克隆的3個單菌落，在LB液體培養基中振蕩培養4h，送北京擎科生物技術有限公司測序驗證。提取經測序驗證正確的菌株質粒作為標準質粒。

1.2.5提取土壤DNA

稱取0.25g過篩細土，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（德國QIAGEN GmbH）提取土壤DNA，將提取的DNA于－20℃冰箱中保存。

1.2.6實時熒光定量PCR

總反應體系為20μL：Platinu SYBR GreenqPCR SuperMix-UDG with ROX（Invitrogen）10μL，pbF（10μmol／L）和pbR（10μmol／L）各0.5μL，DNA模板1μL，ddHO 8μL。反應條件為：50℃熱激活2min，95℃預變性3 min；95℃變性15s，63℃退火30s，72℃延伸30 s，共40個循環；熔解段94℃30s，60℃90s，94℃10s。每個樣品設3次重復，檢測結果取平均值。

1.2.7檢測方法靈敏度

將標準質粒DNA濃度按10倍梯度稀釋為3×10，3X10，3×10，3×10，3×10μg/μL進行qPCR擴增，獲取檢測樣品Ct值，并與常規PCR的最低檢測限對比，分析qPCR檢測體系的靈敏性。

1.2.8實地調查

對湖南各地主要油菜種植區采取實地調查的方式，調查方法為隨機五點取樣法，每點拔4株，共20株，洗凈根部的泥土，根據病害分級標準記錄當地發病程度。分析發病程度與休眠孢子數量的關系。

根腫病苗期病害分級標準：0級：根部無腫瘤；1級：側根有小腫瘤；3級：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上或腫大的根部變黑。

成株期病害分級標準：0級：無病；1級：腫根只附著在側根上，數量占根系全部的1%～25%；2級：主根上有腫根附著，側根上腫根數量占25%以上；3級：腫根數量占50%～75%的根系，主根上有腫根附著；4級：腫根數量占75%以上的根系，主根上有腫根附著。

病情指數=∑（各級病株數×各級代表值）／（調查總株數×最高病級值）×100；

發病率=發病株數／調查總株數×100%。

2結果與分析

2.1引物pbF／pbR的特異性評價

利用針對蕓薹根腫菌的特異性引物pbF和pbR進行PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳后得到目的片段為143 bp，無非特異擴增產物。熒光定量熔解曲線（圖1）只有單個峰值說明該引物特異性良好，擴增產物經測序并與在NCBI數據庫中比對發現，與蕓薹根腫菌部分基因相似性超過99%，可用于檢測根腫菌。

以油菜菌核病核盤菌Sclerotinia sclerotiorum（Lib.） de Bary和油菜黑斑病蕓薹鏈格孢Alternar-ia brassicae （Berk.）Sacc.所提取的DNA模板進行PCR擴增，以ddHO作為空白對照，驗證該引物的特異性。結果表明該引物只對蕓薹根腫菌的基因組DNA進行有效擴增，而其他病害及陰性對照均未出現條帶（圖2），說明該引物對蕓薹根腫菌具有很好的特異性。

2.2質粒標準曲線的建立

將標準質粒按10倍梯度稀釋為5個濃度（3×10，3×10，3×10，3×10，3×10μg／μL）進行擴增，獲得標準曲線（圖3）并計算回歸方程，根腫菌質粒DNA拷貝數（X）的對數和對應的Ct值之間的線性關系表達式為：Ct=－3.561×logX+49.242（R=0.999），擴增效率為90.903%，在濃度3×10～3×10μg/μL范圍內Ct值與標準質粒濃度線性關系良好。質粒拷貝數根據公式進行計算：質粒拷貝數=N·6.02×10/MW·10，N為質粒濃度，單位ng/μL，MW為重組質粒分子量一線性質粒長度×660，660為一個堿基的相對分子質量。

2.3靈敏度檢測

將標準質粒按10倍梯度稀釋后，分別用常規PCR和qPCR進行擴增。結果表明，常規PCR檢測到的最低濃度為3×10μg/μL，低于該濃度無擴增條帶（圖4）。當檢測濃度為3×10-Uμg/μL時Ct值為35. 92，Ct值大于35判定為陰性，熒光定量PCR檢測體系的最低檢測限為3×10μg/μL（Ct=32.05），即qPCR檢測靈敏度比常規PCR靈敏度高100倍。

2.4 qPCR檢測湖南各地土樣休眠孢子數量

對采自湖南懷化市、常德市、岳陽市、吉首市的64份油菜種植區土樣應用qPCR體系檢測可知休眠孢子數量為2.95×10～2.22×10個/g（表1），其中沅陵縣、中方縣和臨澧縣的各鄉鎮發病田塊的休眠孢子含量較高，據實地調查，休眠孢子含量較高的田塊其發病程度也較為嚴重，其中部分發病嚴重的田塊發病率可達100%。沅陵縣筲箕灣3號田塊發病最重，檢測出休眠孢子數目為2.22×10個/g。各地患病土壤中的休眠孢子基本大于10個/g，表明當土壤中休眠孢子數量≥10個/g時，油菜易發生根腫病且土壤中休眠孢子的數量直接影響油菜田的發病程度。

3結論與討論

實時熒光定量PCR技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號實時監測整個PCR反應進程，最后通過標準曲線對起始模板的拷貝數進行定量分析[11]。其檢測方法分為SYBR Green Ⅰ法[12]和TaqMan探針法[13]。本研究采用SYBRGreen I法對蕓薹根腫菌進行定量檢測，SYBR只結合雙鏈DNA，可以通過熔解曲線保證PCR反應的特異性。相較于Taq Man探針法通用性好、價格低、應用廣泛[14]。

如今，實時熒光定量PCR技術在公共衛生[15-16]、食品安全[17-18]、基因篩選[19-20]等領域有著廣泛的應用。在植物病原檢測方面的研究也在不斷深入發展[21]，陳清清等將實時熒光定量PCR技術應用于小麥根腐病菌索氏平臍蠕孢Bipolaris soro-kiniana的檢測[22]。余鵬舉等利用SYBR GreenⅠ法優化建立了檢測核桃膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides實時熒光定量PCR檢測體系[23]。通過實時熒光定量PCR技術對病原菌進行定量檢測可以在短時間內掌握病原菌的變化規律和發展趨勢[24]。

蕓薹根腫菌主要以休眠孢子的形式在土壤中越夏越冬。土壤中休眠孢子數量和發病的嚴重程度有著密切聯系[25]。本研究對湖南各地采集的64份土樣進行了實時熒光定量PCR檢測，明確了湖南各地病田中根腫病菌休眠孢子的數量。當土壤中休眠孢子數量≥104個/g時，油菜易發生根腫病，應及時采取有效防控措施。

實時熒光定量PCR實現了快速、精準地定量檢測田間蕓薹根腫菌的數量，對湖南油菜根腫病的流行監測預警具有重要意義[26]。然而，qPCR依賴于使用合適的引物和合理的DNA模板，并且無法區分活菌和死菌的DNA[27]。因此該檢測方法未來仍需要進一步研究。