長孢輪枝菌犜犪狇Man MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法

段維軍　李雪蓮　呂燕等

關(guān)鍵詞 長孢輪枝菌；實(shí)時(shí)熒光PCR; TaqMan-MGB探針；

檢測

中圖分類號：S 432.44 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh 2022332

長孢輪枝菌Verticillium longisporum（C.Stark） Karapapa，Bainbr.&Heale，隸屬于真菌界Fungi，子囊菌門Ascomycota，盤菌亞門Pezizomy-cotina，糞殼菌綱Sordariomycetes，肉座菌亞綱Hypocreomycetidae，小叢殼目Glomerellales，不整小球囊菌科Plectosphaerellaceae，輪枝菌屬Verti-cillium[1]。該病菌目前主要分布于歐洲的瑞典[2]、德國[3]、英國[4-5]、比利時(shí)[6]、俄羅斯[7]，北美洲的美國[8]和加拿大[3]，亞洲的日本[9]和中國[10]。該病菌在中國局部分布，是近年新發(fā)現(xiàn)的植物病害。

長孢輪枝菌其主要寄主作物是十字花科植物，主要包括油菜Brassica napus、甘藍(lán)B.oleracea、花椰菜B.oleracea var. botrytis、卷心菜B.oleraceavar.capitata、抱子甘藍(lán)B.oleracea var. gemmif-era、苤藍(lán)B.oleracea var. gongylodes、蕪菁B.ra-pa、辣根Armoracia rusticana等[9，11-16]。在有些植物中，長孢輪枝菌與其近似種大麗輪枝菌Verticilli-um dahliae沒有顯著的寄主劃分，例如油菜[2]、辣根[17]、甜菜Beta vulgarjs[18]、擬南芥Arabidopsis thaliana[19-20]和蘿卜Raphanus sativus[21]。致病性測定研究表明，長孢輪枝菌也可侵染非十字花科植物[22]，如小麥Triticum aestivum、豌豆Pisum sati-vum和燕麥Avena sativa[23]。

輪枝菌常隨植物商品貿(mào)易而廣泛擴(kuò)散，如大麗輪枝菌[24]，長孢輪枝菌不產(chǎn)生氣生孢子，是一種土傳病原菌[14]，從該病菌A1／D1株系的廣泛傳播可以看出，人類活動在病害傳播過程中起了重要作用[24]。對病菌進(jìn)行有效快速檢測是防范其危害的重要技術(shù)基礎(chǔ)，可為抗病育種、植物檢疫、防治效果評價(jià)等多項(xiàng)工作提供技術(shù)手段。目前，針對長孢輪枝菌的主要檢測鑒定方法多為形態(tài)學(xué)結(jié)合DNA序列分析方法等[2-5，7，10，15]，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且靈敏度不高。和常規(guī)PCR檢測方法相比，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法具有檢測時(shí)效快、特異性強(qiáng)、靈敏度高和易于操作等優(yōu)點(diǎn)。本研究以長孢輪枝菌的actzn序列片段為靶標(biāo)，建立了基于Taq Man-MGB探針的長孢輪枝菌快速檢測方法，為長孢輪枝菌的檢測提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1供試菌株與引物、探針的設(shè)計(jì)合成

供試菌株共計(jì)46株，分別為：從青海蘿卜上分離鑒定的7株長孢輪枝菌（均為A1／D1株系），從荷蘭微生物菌種保藏中心獲得的2株長孢輪枝菌（CBS 124.64為AID3株系，CBS 110220株系不詳），以及一些其他種屬的植物真菌37株（表1）。以上菌株均保存于本實(shí)驗(yàn)室，采用無菌水保存法保存，備用。

通過分析長孢輪枝菌及其近似種actin基因間的差異，應(yīng)用Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)了特異性引物VLAF1（5′-GTGCCGCGGGCAAA-3′）、VLARl（5′-ACCGACAATGGAAGCTTGAAA-3′）以及探針VLAP1（5′-CTCGACATGATCTTTG-3′），預(yù)期產(chǎn)物大小為62bp（圖1）。引物和TaqMan-MGB探針由上海立菲公司合成。

1.2 DNA提取

1.2.1菌絲DNA提取

用滅菌槍頭刮取PDA平板上培養(yǎng)10 d的菌絲體，根據(jù)TANBeadPlant DNA Auto Kit操作說明，利用自動化核酸提取儀（ThermoFisher，King-fisher mL型），提取DNA。經(jīng)超微量分光光度計(jì)（ThermoFisher，NanoDrop 2000C型）檢測DNA濃度后，保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2組織樣品DNA提取

取蘿卜組織約0.1 g，切成細(xì)絲狀，提取DNA所用設(shè)備及試劑盒同1. 2.1。

1.3引物和探針特異性檢測

采用10μL擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×TaqMan Uni-versal PCR Master Mix 5μL，正向引物VLAF1（10μmol／L）0.5μL，反向引物VLAR1（10μmol／L）0.5μL，探針VLAP1（10 μmol／L）0.5μL，模板（供試菌株）DNA 1μL，超純水2.5μL。以超純水為空白對照。

反應(yīng)條件為：95℃10 min；95℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。

1.4實(shí)時(shí)熒光PCR體系的優(yōu)化

1.4.1引物濃度優(yōu)化

以菌株LV19-5 DNA為模板，正、反向引物濃度分別以0.1μmol／L遞增，分別從0.1μmol／L遞增至1.0μmol／L，1.3體系中其余各成分濃度保持不變，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同1.3。

1.4.2探針濃度優(yōu)化

以菌株LV19-5 DNA為模板，探針濃度以0.1μmol／L遞增，從0.1μmol／L遞增至1.0μmol／L，采用1.4.1優(yōu)化后的引物濃度，1.3體系中其余各成分濃度保持不變，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)條件同1.3。

1.5靈敏度檢測

以菌株LV19-5DNA為模板，用滅菌超純水將DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個(gè)梯度進(jìn)行3次重復(fù)，開展靈敏度檢測。在10μL反應(yīng)體系中，DNA含量分別為10ng、1.0ng、100pg、10pg、1.0pg。利用優(yōu)化后的引物及探針濃度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，反應(yīng)條件同1.3。

1.6重復(fù)性試驗(yàn)

以菌株LV19-5 DNA為模板進(jìn)行重復(fù)性檢測。用上述相同的條件分別進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，分析組內(nèi)、組間差異。計(jì)算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，SD）和變異系數(shù)（coefficient of variation， CV）。

1.7樣品檢測

選取2021年10月從青海采集的蘿卜黑心病感病樣品7份，從寧波菜市場購買的健康蘿卜13份，參照1.2.2方法，取蘿卜肉質(zhì)組織提取DNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測，檢驗(yàn)該方法的實(shí)用性。

2結(jié)果與分析

2.1特異性檢測

在相同條件下，對表1中參試的9株長孢輪枝菌及其他37株菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測。結(jié)果顯示，所選取的來自不同地理來源的9株長孢輪枝菌可擴(kuò)增產(chǎn)生明顯擴(kuò)增曲線，無擴(kuò)增的為其他參試菌及空白對照。說明此實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法具有較好的種特異性。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系優(yōu)化

2.2.1引物濃度優(yōu)化

引物濃度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示，在0.1～0.8μmol／L范圍內(nèi)，Ct值隨著濃度增大而減小，而△Rn值隨著濃度增大而增大。因此，引物的最佳濃度為0.8μmol／L，此時(shí)Ct值最小，并且△Rn值達(dá)到最大（圖2）。

2.2.2探針濃度優(yōu)化

在確定最佳引物濃度的基礎(chǔ)上進(jìn)行探針濃度優(yōu)化試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在0.1～0.8μmol／L范圍內(nèi)，Ct值隨著濃度增大而減小，而△Rn值隨著濃度增大而增大。因此，探針的最佳濃度為0.8μmol／L，此時(shí)Ct值最小，并且△Rn值達(dá)到最大（圖3）。

2.2.3優(yōu)化后的反應(yīng)體系

通過優(yōu)化引物和探針濃度，得到優(yōu)化后的反應(yīng)體系：2×TaqMan Universal PCR Master Mix5μL，引物VLAR1（10μmol／L）0.8μL，引物VLAF1（10μmol／L）0.8μL，探針VLAP1（10μmol/L）0.8μL，DNA 1μL， ddHO補(bǔ)足10μL。

2.3靈敏度檢測及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR最低檢測限是10 pg（圖4）。

通過實(shí)時(shí)熒光PCR檢測已知濃度梯度的總DNA，發(fā)現(xiàn)DNA濃度越高，Ct值越小，3個(gè)平行試驗(yàn)結(jié)果顯示，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=－3.66x+26.83（R=0.9984），x代表DNA濃度的對數(shù)，y代表相應(yīng)的Ct值（圖5）。

2.4重復(fù)性檢測

以菌株LV19-5 DNA的4個(gè)濃度（44、4.4、0.44、0.044ng／μL）進(jìn)行組內(nèi)、組間重復(fù)測定，各3次。通過統(tǒng)計(jì)分析可見，組內(nèi)、組間重復(fù)CV值均小于1%，分別為0.29%～0.90%，0.24%～0.91%，說明本研究所建立的針對長孢輪枝菌的Taq Man-MGB熒光PCR檢測方法，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.5實(shí)際樣品檢測

對收集的20份樣品進(jìn)行檢測，其中7份為表現(xiàn)蘿卜黑心病癥狀樣品，13份為健康的蘿卜樣品。以LV19-5菌株的DNA為陽性對照。結(jié)果表明，20份樣品中，7份疑似長孢輪枝菌感染的蘿卜樣品DNA擴(kuò)增后均可產(chǎn)生熒光信號，健康蘿卜未產(chǎn)生熒光信號（圖6）。

3結(jié)論與討論

輪枝菌是一類土傳真菌，主要引起植物的維管束病害，可導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。在缺乏寄主情況下，病原菌可通過產(chǎn)生微菌核、休眠菌絲和厚垣孢子等休眠結(jié)構(gòu)在土壤中長期存活，以度過不良環(huán)境[25]，由于沒有有效的化學(xué)藥劑，且缺乏有效的抗病品種，生產(chǎn)中往往難以控制輪枝菌所造成的病害[14，26]。開展嚴(yán)格檢疫是防范重要病原菌傳播擴(kuò)散乃至危害的重要技術(shù)手段，而這有賴于準(zhǔn)確、特異、靈敏的檢測方法。在對該屬真菌分類學(xué)研究尚未查清之前，國內(nèi)外針對輪枝菌中的重要病原菌如黑白輪枝菌V.albo_atrum[27-29]，大麗輪枝菌V.dahliae[29-38]，長孢輪枝菌V.longisporum[36]和三體輪枝菌V.tri-corpus[39-40]等已經(jīng)開展了一些研究，建立了基于PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等技術(shù)的檢測方法。但是，上述檢測方法多建立在輪枝菌分類問題有效解決之前，因此準(zhǔn)確性難以得到有效保證。例如黑白輪枝菌，V.albo-atrum sensu lato目前已被劃分為3個(gè)不同的物種V.alfalfae、Vnonalfalfae和V.albo-atrum sensu stricton[15，41]。又如，長孢輪枝菌在很長一段時(shí)間被認(rèn)為是大麗輪枝菌的一個(gè)變種即大麗輪枝菌長孢變種Verticillium dahliae var.longispo-rum C.Stark，其分生孢子中DNA含量接近大麗輪枝菌的1.75倍[2，42-43]，長孢輪枝菌在細(xì)胞骨架蛋白（ACT）、翻譯延伸因子（EF）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GPD）、線粒體草酰乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（OX）和色氨酸合酶（TS）等多個(gè)基因上具有等位基因，但在核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）片段上不具有等位基因[16]。很明顯，在獲得上述科學(xué)認(rèn)知之前，針對輪枝菌不同種類的快速檢測存在很大局限性。

迄今為止，國內(nèi)外已經(jīng)開展了一些長孢輪枝菌檢測技術(shù)的研究。Yu等[44]采用核糖體小亞基mtSSU rDNA和細(xì)胞色素b（cytochrome b）序列分析等方法，將北京地區(qū)大白菜黃萎病病原鑒定為長孢輪枝菌，并根據(jù)其核糖體ITS序列設(shè)計(jì)了特異性引物HWl-F/HW1-R，建立了該病菌的快速檢測方法，但特異性研究中未能包括長孢輪枝菌近似種，如V.alfalfae、V.nonal falfae等，因此其特異性難以保證。Banno等[9]根據(jù)ITS、mtSSU-rDNA、cyto-chrome b、交配型（mating type）基因序列，結(jié)合RAPD研究，將日本群馬縣的甘藍(lán)Brassica olera-cea var.capitata黃萎病病原鑒定為長孢輪枝菌。苗增建等[10]采用形態(tài)學(xué)與ITS序列分析相結(jié)合的方式，鑒定出引起青海省蘿卜黑心病的病原為長孢輪枝菌、三體輪枝菌和瓜小織球殼菌Plectos phae-rella cucumerina。呂燕等[45]采用形態(tài)學(xué)特征觀察結(jié)合多基因序列分析，進(jìn)一步將青海地區(qū)蘿卜黑心病病原鑒定為長孢輪枝菌A1／D1株系。此類檢測鑒定方法建立在序列分析基礎(chǔ)之上，耗時(shí)較長。In-derbitzin等[46]建立了針對多種輪枝菌的特異性PCR和多重PCR檢測方法，但對于親緣關(guān)系較近的種類，如大麗輪枝菌和長孢輪枝菌，無法通過特異性PCR區(qū)分，需要采用多重PCR才能加以區(qū)分，但該研究未對反應(yīng)靈敏度進(jìn)行研究，同時(shí)也僅采用分離株提取的DNA進(jìn)行了驗(yàn)證，未在實(shí)際帶菌樣品中開展檢驗(yàn)。特異性和靈敏度，是研究快速檢測技術(shù)中最重要的考慮因素[47]。本研究在以ITS為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物和探針過程中發(fā)現(xiàn)，長孢輪枝菌及其近似種ITS片段高度相似，難以設(shè)計(jì)出合適的引物和探針，因此改用actin片段作為靶標(biāo)。為了設(shè)計(jì)出能夠有效區(qū)分長孢輪枝菌的引物和探針，借鑒了輪枝菌屬最新分類成果，在引物探針設(shè)計(jì)階段對長孢輪枝菌及其近似種的多個(gè)基因序列進(jìn)行了比對，最終篩選出變異區(qū)段較大且位于共同親本A1的actin片段為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物探針，該靶標(biāo)存在于長孢輪枝菌3種不同株系中，且同源性較高，保證了特異性。同時(shí)，為了驗(yàn)證其特異性，我們在特異性試驗(yàn)中收集了長孢輪枝菌近似種V.alfae、V.nonalfalfae、V.albo-atrum、V.dahliae和V.tricorpus作為參試菌株，同時(shí)也包括了原劃分在輪枝菌屬中的Gibellu-lopsis nigrescens等菌株進(jìn)行特異性驗(yàn)證。另外，供試長孢輪枝菌中包括了長孢輪枝菌模式分離物CBS124.64。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，本文所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法對不同寄主來源或株系的長孢輪枝菌菌株均可檢出，其他近似種或供試菌均不能檢出，具有較好的種間特異性和種內(nèi)一致性。

大多數(shù)已知的真菌雜交種報(bào)道與植物病原體相關(guān)，由于全球貿(mào)易等人類活動影響，造成以前地理隔離的物種之間相互接觸并雜交，從而產(chǎn)生毒力增強(qiáng)和寄主范圍擴(kuò)大的新病原[48-49]。長孢輪枝菌起源于3次不同時(shí)間的進(jìn)化。長孢輪枝菌有1個(gè)共同的親本A1和3個(gè)不同的親本D1、D2和D3，其中A1和D1親本可能來源于未知的輪枝菌種類，而D2和D3親本則可能源自大麗輪枝菌[16]。長孢輪枝菌不同株系間分離物存在致病性差異，如A1／D1和A1／D3株系常見于多種十字花科植物上。A1／D1株系主要報(bào)道于油菜上，在油菜上致病力最強(qiáng)[50]。目前分布在法國、德國、瑞典、加拿大、美國和日本等國家，但是在油菜以外的寄主植物上也有相關(guān)發(fā)生報(bào)道[25，45，51-52]。而A1／D2株系則僅見于辣根上[16，53]。本研究所設(shè)計(jì)的檢測靶標(biāo)位于長孢輪枝菌A1親本分支actin序列上，由于長孢輪枝菌3種不同株系均含有Al親本序列，因此，本研究所建立方法能夠檢測目前已經(jīng)報(bào)道的長孢輪枝菌全部3個(gè)株系。在今后的研究工作中，可進(jìn)一步針對長孢輪枝菌不同株系特征序列設(shè)計(jì)檢測方法，以實(shí)現(xiàn)針對特定株系的快速檢測。

Taq Man實(shí)時(shí)熒光PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，增加1條熒光標(biāo)記的特異性探針，在完全封閉條件下通過熒光信號的強(qiáng)弱來實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單和不易污染等優(yōu)點(diǎn)[54-55]。截至目前，國內(nèi)外已有大量采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測植物病原真菌的相關(guān)研究與報(bào)道[33-34，36，38，47，55-57]，其靈敏度通常在1 pg左右。本研究中檢測靈敏度為10pg，與以往針對其他病菌actin片段為靶標(biāo)的檢測靈敏度相似[55]，可能是由于本檢測靶標(biāo)位置在A1親本的actin片段上，而該片段在長孢輪枝菌DNA中拷貝數(shù)較低故含量較低所致。DNA檢測靶標(biāo)片段對于靈敏度有較大影響，通常基于ITS片段的引物探針靈敏度更高，例如向日葵黑莖病菌Plenodomus lindquistii靈敏度可達(dá)0.1 pg[47]，杜鵑花枯萎病菌Ovulinia azaleae可達(dá)0.25 pg[56]，這可能是ITS片段在上述病菌DNA中拷貝數(shù)較多，因此相對含量較高所致。應(yīng)用此方法，可成功從疑似受長孢輪枝菌侵染的蘿卜樣品中檢測鑒定長孢輪枝菌。本檢測技術(shù)也可進(jìn)一步用于其他疑似受該菌侵染樣品的檢測，如土壤、種子和植株等受侵染樣品。

利用TaqMan-MGB探針，本研究首次建立了長孢輪枝菌實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測方法，通過優(yōu)化反應(yīng)體系，確定了最佳引物終濃度和探針終濃度，均為0.8μmol／L;通過靈敏度試驗(yàn)，確定了最低檢測限量為10μL反應(yīng)體系中總DNA含量10 pg。該方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高，檢測過程完全閉管，無PCR后續(xù)處理需求，減少了PCR產(chǎn)物的污染，簡化了檢測步驟，節(jié)約了時(shí)間，具有良好的應(yīng)用前景。