智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草生長和病毒抗性的影響

張曉英　王勝　王洪鳳等

關鍵詞 馬鈴薯Ｘ病毒； 智能聰； 促生； 抗病； 殼寡糖； 褐藻寡糖

中圖分類號： Ｓ４３２．４ 文獻標識碼： Ａ DOI： １０．１６６８８／ｊ．ｚｗｂｈ．２０２２２２８

植物病毒病嚴重阻礙農業綠色生產和可持續發展。馬鈴薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）是世界范圍內在煙草和馬鈴薯等作物上普遍發生且危害嚴重的侵染性病毒［１２］。由ＰＶＸ引起的煙草花葉病造成煙草減產１０％～８０％［３］，對以煙葉為支柱產業的地區和煙農造成巨大經濟損失［４］。由于病毒的絕對寄生性，目前針對植物病毒沒有特效藥劑。

殼寡糖是植物識別病原物的非特異性信號，通過誘導植物本身的防衛反應提高其對病害的抵抗能力［５］，殼寡糖在田間對煙草花葉病毒病的防治效果可達２０％～４０％［６］。褐藻寡糖不僅具有抗菌和抗氧化作用，還能調節植物免疫應答［７８］，盆栽試驗發現０．２０％的褐藻寡糖可以有效誘導植物抵抗煙草花葉病毒病（ｔｏｂａｃｃｏｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ，ＴＭＶ）的侵染，對病毒抑制率可達９０．４％［９］。宛氏擬青霉Paecilo-myces variotii經過發酵獲得的提取物智能聰（ＺＮＣ）是一種超高活性的植物免疫誘抗劑，可以作為誘導因子誘導植物免疫應答，引起植物體內活性氧（ＲＯＳ）暴發、胼胝質沉積和病程相關蛋白基因（ｐｒｏ-ｔｅｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ，ＰＲ）的表達；智能聰通過苯丙氨酸解氨酶（Ｌ-ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎａｍｍｏｎｉａ-ｌｙａｓｅ，ＰＡＬ）途徑促進水楊酸（ｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄ，ＳＡ）的積累，調控ＲＮＡ 沉默相關標志基因NBDCL３的表達來提高煙草抗ＰＶＸ的能力［１０］，盆栽和田間試驗均表現出對病毒病有較為顯著的防治效果［１１１２］。

目前，農藥仍是馬鈴薯Ｘ 病毒病的重要防治手段，但也隨之造成嚴重的人畜健康、環境安全及病毒抗藥性問題，阻礙了煙草行業的健康發展。為篩選能夠有效防治馬鈴薯Ｘ 病毒病的藥劑，本試驗以模式植物本氏煙為研究對象，研究智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草生長的促進作用及抵抗ＰＶＸ侵染的效果，為防治由ＰＶＸ引起的煙草花葉病毒病的復配藥劑篩選提供科學依據。

１材料與方法

１．１試驗材料

宛氏擬青霉Puecilom yces variotii提取物智能聰，有效成分７．５ｍｇ／ｍＬ，由山東蓬勃生物科技有限公司提供；９０％殼寡糖原藥和９０％褐藻寡糖原藥由南陽樸欣肥業有限公司提供。

供試植物為本氏煙Nicotiana benthamiana。挑選大小、長勢一致、無病無蟲的４～８葉齡幼苗用于試驗。

帶有綠色熒光蛋白（ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）基因的馬鈴薯Ｘ病毒（ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＸ，ＰＶＸ）由山東農業大學朱常香老師課題組提供。

其他試劑和儀器主要有：石英粉（過６００目篩）、碳酸鹽緩沖溶液（ＣＢＳ，ｐＨ９．６）、馬鈴薯Ｘ 病毒酶聯免疫分析試劑盒（上海源桔生物科技有限公司）、酶標分析儀（美國伯騰儀器有限公司）、３６５ｎｍ 長波紫外燈（美國ＳＰＥＣＴＲＯＬＩＮＥ）、研磨器等。

１．２試驗方法

試驗在溫度２３℃，相對濕度５０％～６０％，光照６０００～７０００ｌｘ的人工氣候室中進行。藥劑用水稀釋后均勻噴施于長勢均勻的煙草植株葉片正面，以噴施清水為對照（ＣＫ）。每７ｄ噴施１次，共噴霧２次。試驗設６個處理（表１），每處理噴施６株，即６個重復。

病毒接種試驗在第２次噴施藥劑后２ｈ進行，首先在煙草未完全展開幼葉下方的３片展開葉正面均勻撒少許石英粉，采用摩擦接種的方式每葉接種５０μＬ含ＰＶＸ 的病毒汁液，每處理接種６株，即６個重復，接種后將植株放于人工氣候室內繼續培養，５ｄ后在長波紫外光下觀察接種煙草發病情況，取每株發病的幼葉，用錫箔紙包裹并寫好編號，于液氮速凍后保存于－８０℃冰箱中待用。

１．３生長指標及開花數量測定

分別測量第１次噴藥前、第１次噴藥后７ｄ、第２次噴藥后７ｄ各處理的株高，并于第２次施藥后７ｄ測量各處理煙草的根長、側根數、全株鮮重和干重，統計開花數量。

１．４ELISA檢測病毒含量，計算病毒抑制率

取接種病毒后５ｄ已發病的不同處理葉片樣品按照０．１ｇ（葉片重量）∶１ｍＬ（碳酸鹽緩沖溶液）的比例進行研磨，研磨液倒入離心管里，５０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ，取上清液于干凈的離心管內，按照馬鈴薯Ｘ病毒酶聯免疫分析試劑盒的操作步驟測定樣品中馬鈴薯Ｘ病毒含量，以４５０ｎｍ波長處的ＯＤ值表示。

參照馬志強等的方法［１３］，以對照和處理之間的馬鈴薯Ｘ病毒含量（ＯＤ）的差異計算各處理對病毒的抑制率。

病毒抑制率＝（對照組ＯＤ－處理組ＯＤ）／對照組ＯＤ×１００％。

１．５數據分析

試驗所得數據采用ＳＰＳＳ１４．０軟件中ＤＭＲＴ法進行顯著性檢驗并計算各處理的標準誤差，采用ＩｍａｇｅＪ軟件進行發病葉片熒光強度的量化。

２結果與分析

２．１智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草生長的影響

智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草株高的促進作用顯著優于單劑。噴施兩次不同單劑后，幼苗株高均顯著高于對照。其中，第１次噴施后７ｄ，智能聰處理組的株高比對照增加１７．９１％，殼寡糖處理組增加１３．４６％，褐藻寡糖處理組增加８．６３％。第２次噴施后７ｄ，株高增加率分別為１９．５０％、１１．２５％和１１．４８％，其中智能聰處理株高顯著高于其他２個單劑處理，促生效果最好。智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草幼苗株高的促進作用均顯著高于單劑，其中智能聰與殼寡糖復配處理的煙草株高比單施殼寡糖增加１３．８９％～２５．２４％，與褐藻寡糖復配處理的煙草株高比單施褐藻寡糖增加２６．３１％～４８．７０％（圖１）。

智能聰與殼寡糖和褐藻寡糖復配均表現出較好的促根系生長作用。智能聰與殼寡糖復配處理的主根長、鮮重顯著高于殼寡糖單用（犘＜０．０５），分別增加１６．００％、１５．５７％，側根數、干重雖高于殼寡糖單劑處理，但差異不顯著，分別增加１１．９５％、１６．６０％。智能聰與褐藻寡糖復配處理的主根長、側根數、鮮重和干重顯著高于褐藻寡糖單劑處理，分別增加２０．４１％、２３．２０％、２３．６０％和３１．０３％（圖２）。這表明，智能聰配施褐藻寡糖對煙草生長具有較好的促進作用。

２．２智能聰配施殼寡糖和褐藻寡糖對煙草植株開花的影響

施用智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖可增加煙草植株的開花數量，其中智能聰和殼寡糖配施時促進作用最好。殼寡糖和褐藻寡糖分別配施智能聰相對單劑表現出較好的增效作用，其中，殼寡糖與智能聰復配時開花數量比單劑處理增加５６．２５％；褐藻寡糖與智能聰復配時開花數量比單劑處理增加８３．３４％（圖３）。

２．３智能聰配施殼寡糖及褐藻寡糖對煙草對PVX病毒抗性的影響

葉面噴施各處理藥劑后２ｈ接種ＰＶＸ病毒，培養５ｄ后在長波紫外燈下觀察各處理葉片的熒光強度，并檢測發病煙草植株葉片的病毒含量。結果顯示，各處理組葉片的熒光強度經過量化后存在顯著差異，其中熒光強度最低的是智能聰配施殼寡糖，抑制效果最為明顯（圖４，圖５）。各處理組煙草葉片中病毒的含量均顯著低于對照，其中病毒含量最低的為智能聰復配殼寡糖，其次為智能聰復配褐藻寡糖處理（圖６）。３種藥劑單用對ＰＶＸ均有較好的抑制作用，智能聰處理顯著優于殼寡糖和褐藻寡糖處理，病毒抑制率分別為６６．８６％、４８．１１％和４５．５０％（表２）。智能聰與殼寡糖或褐藻寡糖配施均能較好地抑制ＰＶＸ，其中與殼寡糖配施處理對病毒抑制率為７１．２６％，與褐藻寡糖配施時病毒抑制率為６８．４８％。因此，智能聰對兩種藥劑均有較明顯的增效作用，與殼寡糖復配對病毒的抑制作用比殼寡糖單用增加４８．１２％，與褐藻寡糖復配比褐藻寡糖單用增加５０．６５％（圖６，表２）。

３結論與討論

３．１智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對煙草的促生作用

本研究發現，施用智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對煙草幼苗的生長均表現出較好的促進作用，與之前的報道基本一致［１２，１４１５］。為了進一步提高藥劑效果，本研究將智能聰分別配施殼寡糖和褐藻寡糖，評價其對煙草促生和抗病毒病的效果。研究結果證明復配制劑對煙草的促生作用顯著高于單用殼寡糖和褐藻寡糖。智能聰可促進擬南芥的生長、發育［１６］，本研究發現其也能促進煙草的生長，但關于智能聰如何調控煙草生長的機制還需進一步研究。

３．２智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對煙草的抗病作用

免疫誘抗劑智能聰對田間的煙草病毒病具有較好的防治效果，葉面噴施１ 次５００ｎｇ／ｍＬ 的智能聰，對煙草病毒病的防治效果可達５７．０７％［１２］，本研究顯示，葉面噴施２次５０ｎｇ／ｍＬ的智能聰對ＰＶＸ的抑制率可達６６．８６％，可能是試驗所用的煙草品種不同，并且室內培養條件下病毒來源等穩定可控，而田間環境因素復雜多變，煙草病毒病多是多種病毒復合侵染，因此存在一定的差異。

褐藻寡糖主要是通過水楊酸（ＳＡ）信號途徑及胼胝質沉積等抵抗ＰＶＸ、ＴＭＶ 的侵入［１７］，進而增強煙草對兩種病毒的抗性。殼寡糖主要通過誘導煙草表皮產生ＨＯ 和ＮＯ信號分子來提高煙草抗病毒侵染的能力［１８］，因此其對ＴＭＶ 具有較好的防治效果，本試驗中對ＰＶＸ的防治效果均與上述結果相符。褐藻寡糖在室內煙草抗ＴＭＶ 試驗中對ＴＭＶ的抑制率可達９０．４％［９］，而本試驗中褐藻寡糖對ＰＶＸ的抑制率較低，可能是試驗所用病毒不同以及褐藻寡糖用量較少。

智能聰分別與殼寡糖和褐藻寡糖復配對病毒的抑制均表現出較好的作用。其中效果最好的是智能聰與殼寡糖復配，對病毒的抑制率為７１．２６％；其次是智能聰與褐藻寡糖復配，病毒抑制率為６８．４８％。兩種復配對ＰＶＸ的抑制率存在一定差異，具體原因還有待進一步研究。

本試驗結果表明，智能聰、殼寡糖和褐藻寡糖對煙草均有較好的促生作用并能提高煙草抗ＰＶＸ的能力。智能聰與殼寡糖和褐藻寡糖復配，對煙草的促生作用和抗病毒效果顯著優于單劑，其中促生效果最好的復配制劑為０．０５μｇ／ｍＬ的智能聰加１２μｇ／ｍＬ的褐藻寡糖，抗馬鈴薯Ｘ病毒效果較好的復配制劑為０．０５μｇ／ｍＬ的智能聰加３０μｇ／ｍＬ的殼寡糖。