不同草本植物對銅鎳復合脅迫的生理耐受性

李景峰,郭全恩,梁鵬飛,何海鵬,南麗麗

(1.甘肅農業大學草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室 甘肅 蘭州 730070;2.甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所,甘肅 蘭州 730070)

隨著人類經濟社會的迅速發展,礦山開采、化肥農藥施用、生活垃圾和交通運輸等過程中產生的大量重金屬元素被排放到土壤、水體中,導致土壤、生物和水資源受到不同程度的重金屬污染,造成土壤地力下降、農作物被污染,生態環境遭到破壞[1-2]。銅(Cu)和鎳(Ni)是工農業生產中較為常見的2種重金屬元素,可被植物吸收積累在可食用部位,并通過食物鏈的傳遞進入人及牲畜體內,危害人類健康[3]。因此,探索出科學、高效、合理的重金屬修復措施有利于人類健康和環境的可持續發展,而植物修復以其環保、高效、成本低等優勢,被廣泛用于重金屬污染土壤的修復[4]。近年來,我國在Cu、Ni耐性及超累積植物研究方面取得了一定的進展[5-6],但實際生產中需要修復的土壤多是2種或2種以上重金屬復合污染,復合污染的毒害作用比單一元素的污染復雜很多[7],大大增加了重金屬污染土壤的植物修復難度。因此,篩選耐復合銅鎳脅迫植物及與耐復合銅鎳性能相關的指標已迫在眉睫。

Cu、Ni對植物產生的毒害首先會引起植物生理指標變化,其可能與蛋白質結合,抑制酶活性,也可能通過破壞質膜的通透性阻礙植物的正常代謝,引起植物萎黃、根畸形和生長遲緩[6,8-9]。大量研究發現Cu、Ni脅迫對植物光合作用、滲透調節物質、酶活性以及根系生長會產生影響,李芹梅等[10]針對Cu2+對滇水金鳳(Impatiensuliginosa)花色變化生理研究結果顯示,隨著Cu2+含量增加,植物花瓣可溶性糖和可溶性蛋白含量下降,而類胡蘿卜素和脯氨酸含量變化不明顯;劉麗杰等[11]研究表明,銅鎳復合脅迫造成車前草(Plantagoasiatica)株高和生物量顯著降低,葉綠素含量先升后降,MDA含量、POD、SOD活性和CAT活性顯著升高;朱成豪等[12]通過研究銅、鋅、鎘復合脅迫對麻瘋樹(Jatrophacurcas)幼苗生長的影響發現,麻風樹幼苗可溶性糖含量和根系活力隨復合脅迫濃度增加呈先升后降趨勢。由此可見,重金屬脅迫對植物生理指標影響較為明顯,篩選與耐銅鎳復合脅迫密切相關的生理指標較為重要,可為后期篩選更多的耐銅鎳復合脅迫植物提供捷徑。前人已研究發現了一些耐銅或耐鎳植物,但這些植物大多生物量小,修復土壤所需時間較長,修復效率較低[13]。因此本研究選用生物量大(清水苜蓿和鷹嘴紫云英)和可以多次刈割(黑麥草和早熟禾)的草本植物進行銅鎳復合污染修復試驗,以篩選出對銅鎳復合脅迫耐受性較好的植物及其耐銅鎳指標,為土壤重金屬污染修復及尋找耐重金屬污染植物提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為苗期篩選的耐銅鎳植物[14]‘卡特’多年生黑麥草(Loliumperenne‘Cutter’),‘午夜草地’早熟禾(Poapratensis‘Midnight’),‘清水’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Qingshui’),‘盧塔納’鷹嘴紫云英(Astragalussinicus‘Lutana’),種子由甘肅農業大學草業學院提供;供試土壤取自甘肅省金昌市金川礦區農田土壤(Ni、Cu背景值含量分別為258.2 mg·kg-1和261.1 mg·kg-1),采集土樣經自然風干后去除雜物、研磨、過100目篩,待用。

1.2 試驗設計

試驗在甘肅省農業科學院溫室進行,將22.5 kg過篩土壤裝入口徑、底徑、高為34.5、23.0、44.5 cm的花盆中,于2021年4月23日播種經10% H2O2溶液消毒后的供試植物種子,其中早熟禾和黑麥草播量為40 kg·hm-2,播深2～3 cm;鷹嘴紫云英和紫花苜蓿播量為20 kg·hm-2,播深1～2 cm。出苗后間苗,每盆保留生長一致、分布均勻的幼苗30株,待生長至開花初期(10%開花),設置6個銅鎳復合脅迫濃度梯度,各復合脅迫中銅和鎳濃度均為0(CK)、100、200、400、800、1 600 mg·kg-1,用CuCl2·2H2O和NiCl2·6H2O轉化成質量,配成1 L溶液,每盆每5 d澆銅鎳復合液500 mL,待生長20 d后采樣測定其相關生理指標,每個處理重復4次。

1.3 測定指標及方法

株高差:處理前后定株,用卷尺測10個植株株高取平均值,株高差=處理后株高-處理前株高。

地上、地下生物量及根冠比:每盆取10個植株,地上、地下部位分離后烘干,分別稱重,即為地上和地下生物量;根冠比=地下生物量/地上生物量。

生理指標參考鄒琦[15]的方法進行,其中可溶性糖(Soluble sugar)含量采取蒽酮比色法測定,可溶性蛋白(Soluble protein)含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定,脯氨酸(Proline)含量采用酸性茚三酮比色法測定,過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性采用愈創木酚法測定,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光化還原法測定,過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定,根系活力(Root activity)采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定,葉片相對含水量(Relative water content)采用飽和稱重法測定,葉綠素a(Chlorophyll a,Chl a)、葉綠素b(Chlorophyll b,Chl b)、類胡蘿卜素(Carotenoid)、葉綠體色素(Chloroplast pigment, Chl)含量采用分光光度法測定;植物葉、莖、根中的銅(Cu2+)、鎳(Ni2+)含量采用灰化消解處理及原子吸收分光光度計法[16]測定。

1.4 數據統計分析

采用Excel 2010進行圖表制作,利用SPSS 20.0進行方差、回歸分析。各指標耐銅鎳系數=銅鎳脅迫下的測定值/CK測定值[17]。采用隸屬函數對供試植物進行耐銅鎳綜合評價,其中與銅鎳脅迫正相關的指標采用公式Fij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計算,與銅鎳脅迫負相關的指標采用公式Fij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)計算,式中,Fij為i品種的j性狀測定的具體隸屬值;Xij為i品種j性狀測定值;Xjmin為j性狀中測定的最小值;Xjmax為j性狀中測定的最大值。

權重采用客觀賦權法進行計算:正相關指標計算公式為Ij=Cj/Sj,負相關指標計算公式為Ij=Sj/Cj,式中,Ij是一個無量綱數,反映該評價指標CK與銅鎳處理下測定值之比;Cj為第j個指標的CK測定值;Sj為第j個指標在脅迫處理下的測定值。最后通過歸一化,計算出每個評價指標的權重Wj=Ij/∑Ij,綜合評價值D=∑(Fij×Wj)[18]。

2 結果與分析

2.1 銅鎳脅迫對供試植物生長的影響

由圖1A可知,供試植物株高差均為正值,表明株高在銅鎳脅迫后較脅迫前均有所增加,但株高差隨銅鎳脅迫程度加劇呈降低趨勢,表明銅鎳脅迫濃度越大,株高受抑制作用越明顯。當銅鎳濃度為1 600 mg·kg-1時,相比CK,株高降幅以黑麥草最大(90.54%),早熟禾最小(86.83%)。

銅鎳脅迫下,供試植物地上和地下生物量均隨銅鎳濃度增加呈減小趨勢,在濃度為1 600 mg·kg-1時,相比CK,黑麥草、早熟禾、紫花苜蓿和鷹嘴紫云英的地上和地下生物量分別降低53.60%和69.90%、61.50%和82.25、49.40%和44.44%、50.67%和62.94%,所有脅迫濃度下,鷹嘴紫云英的地上生物量和紫花苜蓿的地下生物量顯著(P<0.05)高于同一脅迫濃度下的其他植物(圖1C、1D)。

由圖1B可知,銅鎳脅迫下,除紫花苜蓿根冠比高于CK外,其余植物的根冠比呈先增后降趨勢,其中黑麥草和紫花苜蓿的根冠比在銅鎳濃度為100 mg·kg-1時達到最大,早熟禾和鷹嘴紫云英的根冠比在銅鎳濃度為200 mg·kg-1時達到峰值,且紫花苜蓿的根冠比在銅鎳脅迫下均大于1,其余植物的根冠比則均小于1。

2.2 銅鎳脅迫對供試植物葉綠素含量的影響

圖2顯示,隨著銅鎳復合脅迫濃度增加,4種植物的葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和葉綠體色素(Chl)含量均降低,類胡蘿卜素含量均逐漸增加,其中早熟禾的Chl含量呈波動降低趨勢。與相應CK相比,黑麥草、早熟禾、紫花苜蓿的Chl a含量,黑麥草、早熟禾、鷹嘴紫云英的Chl b含量以及4種植物的Chl含量均在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著降低(P<0.05),鷹嘴紫云英的Chl a含量及紫花苜蓿的Chl b含量均在脅迫濃度為200 mg·kg-1時開始顯著降低(P<0.05);黑麥草、早熟禾、鷹嘴紫云英的類胡蘿卜素含量在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著增加(P<0.05),紫花苜蓿在脅迫濃度為200 mg·kg-1時開始顯著增加(P<0.05)。當脅迫濃度≤200 mg·kg-1時,鷹嘴紫云英的Chl a含量顯著高于其他植物(P<0.05);所有脅迫濃度下,紫花苜蓿的Chl b含量顯著高于其他植物(P<0.05);當脅迫濃度≤800 mg·kg-1時,紫花苜蓿的Chl含量顯著高于其他植物(P<0.05);當脅迫濃度≥400 mg·kg-1時,早熟禾的類胡蘿卜素含量顯著高于其他植物(P<0.05)。當脅迫濃度為1 600 mg·kg-1時,與CK相比,Chl a、Chl b和Chl含量分別以紫花苜蓿(44.26%)、鷹嘴紫云英(70.22%和36.59%)降幅最大,以黑麥草(24.47%)、紫花苜蓿(45.91%)和黑麥草(25.04%)降幅最小;類胡蘿卜素含量以紫花苜蓿增加最多,是CK的13.83倍,黑麥草增加最少,是CK的6.76倍。

注:不同小寫字母表示同一植物不同脅迫濃度之間差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示同一濃度下不同植物間差異顯著(P<0.05)。下同。

圖2 銅鎳脅迫對供試植物葉綠素含量的影響

2.3 銅鎳脅迫對供試植物葉片相對含水量和根系活力的影響

由圖3可知,4種植物葉片相對含水量和根系活力均隨銅鎳復合脅迫濃度的升高而降低。與相應CK相比,黑麥草的葉片相對含水量在所有脅迫濃度下均顯著降低(P<0.05),而其余植物在脅迫濃度為400 mg·kg-1時才開始顯著下降(P<0.05)。不同植物根系活力均在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始較CK顯著降低(P<0.05);且在不同脅迫濃度下,早熟禾的根系活力均高于其他植物。當脅迫濃度為1 600 mg·kg-1時,與CK相比,葉片含水量降幅為紫花苜蓿最大(20.98%),黑麥草最小(17.59%);根系活力降幅則為鷹嘴紫云英最大(69.32%),黑麥草最小(14.71%)。

2.4 銅鎳脅迫對供試植物滲透調節物質及MDA含量的影響

圖4顯示,隨銅鎳脅迫濃度的升高,供試植物的可溶性糖和可溶性蛋白含量呈先逐漸增大后減小的趨勢。與相應CK相比,黑麥草和早熟禾的可溶性糖含量在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著增加(P<0.05),紫花苜蓿和鷹嘴紫云英的可溶性糖含量在脅迫濃度為400 mg·kg-1時顯著升高(P<0.05);4種植物在脅迫濃度為800 mg·kg-1時可溶性糖含量均顯著升高至最大值(P<0.05),黑麥草較CK增加最多(8.44倍),紫花苜蓿增加最少(3.65倍)(圖4A)。與相應CK相比,黑麥草和鷹嘴紫云英的可溶性蛋白含量均在脅迫濃度為200 mg·kg-1時開始顯著增加(P<0.05),早熟禾和紫花苜蓿則在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著升高(P<0.05),4種植物均在脅迫濃度為800 mg·kg-1時達到峰值,與CK相比,早熟禾上升最多(327.81%),黑麥草上升最少(65.93%)(圖4B)。

供試植物的脯氨酸和MDA含量均隨銅鎳脅迫濃度的升高持續上升,且均在濃度為1 600 mg·kg-1時升至最高,此濃度下與CK相比,脯氨酸和MDA含量分別以早熟禾(11.60倍)和黑麥草(62.90%)增加最多,以紫花苜蓿(3.35倍和40.62%)增加最少。與相應CK相比,黑麥草和鷹嘴紫云英的脯氨酸含量在脅迫濃度為200 mg·kg-1時開始顯著增加(P<0.05),早熟禾和紫花苜蓿則在脅迫濃度為100 mg·kg-1時即開始顯著上升(P<0.05);相同脅迫濃度下,紫花苜蓿的脯氨酸含量均顯著高于其他植物(P<0.05)(圖4C)。與CK相比,4種植物的MDA含量均在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著升高(P<0.05);所有脅迫濃度下,紫花苜蓿的MDA含量均高于相同濃度處理的其他植物(圖4D)。

2.5 銅鎳脅迫對供試植物抗氧化酶活性的影響

由圖5可知,供試植物的SOD、POD和CAT活性均隨銅鎳脅迫濃度的增加呈先升后降趨勢,且均在脅迫濃度為100 mg·kg-1時開始顯著上升(P<0.05)。黑麥草的SOD活性在脅迫濃度為800 mg·kg-1時最大,早熟禾、紫花苜蓿、鷹嘴紫云英的SOD活性在脅迫濃度為400 mg·kg-1時升至最高;與CK相比,各植物SOD活性最大值增幅為黑麥草(107.55%)最大,早熟禾(30.20%)最小(圖5A)。4種植物的POD和CAT活性均在脅迫濃度為800 mg·kg-1時達到峰值,之后隨脅迫濃度增加顯著下降(P<0.05),其峰值與CK相比,POD和CAT活性增幅分別以鷹嘴紫云英(176.93%)和紫花苜蓿(85.87%)最大,以黑麥草(131.65%)和鷹嘴紫云英(72.42%)最小(圖5B、5C)。

圖3 銅鎳脅迫對供試植物葉片相對含水量及根系活力的影響

圖4 銅鎳脅迫對供試植物滲透調節物質及MDA含量的影響

圖5 銅鎳脅迫對供試植物抗氧化酶活性的影響

2.6 各供試植物根、莖、葉中Cu2+和Ni2+分布規律

由圖6、圖7可知,供試植物根、莖、葉中Cu2+和Ni2+含量均隨著銅鎳脅迫濃度的升高而升高。黑麥草和早熟禾植株體內的Cu2+含量表現為根>莖>葉,紫花苜蓿體內的Cu2+含量表現為葉>莖>根;當銅鎳脅迫濃度≤100 mg·kg-1時,鷹嘴紫云英體內的Cu2+含量根略大于莖,其他脅迫濃度下其體內的Cu2+含量表現為葉>莖>根(圖6)。各供試植物根、莖、葉中Ni2+含量分布不同,其中黑麥草在<800 mg·kg-1脅迫下各器官Ni2+含量表現為莖>葉>根,而在高濃度(≥800 mg·kg-1)脅迫下,各器官Ni2+含量表現為莖>根>葉;早熟禾的各器官Ni2+分布表現為根>莖>葉,紫花苜蓿和鷹嘴紫云英的各器官Ni2+分布表現為葉>莖>根(圖7)。

圖6 銅鎳脅迫下各供試植物體內Cu2+含量分布規律

圖7 銅鎳脅迫下各供試植物體內Ni2+含量分布規律

2.7 供試植物耐銅鎳性能評價及指標篩選

利用19項生理指標各脅迫濃度下的值進行隸屬函數加權平均,對4種供試植物進行耐銅鎳脅迫能力綜合評價(表1),其強弱表現為:紫花苜蓿(0.565)>鷹嘴紫云英(0.538)>早熟禾(0.449)>黑麥草(0.448)。

為分析各生理指標與植物耐銅鎳性之間的關系,探討植物耐銅鎳鑒定指標,需建立可靠的耐銅鎳性評價模型。因此,對19個生理指標進行逐步線性回歸分析,以各脅迫濃度下耐銅鎳性評價值為因變量,各單項指標耐銅鎳系數為自變量,進行耐銅鎳指標預測,并建立最優回歸方程[19]：Y=0.225X1-0.015X2-0.015X3-0.019X4+0.078X5-0.011X6+0.355(R2=0.989),其中,X1、X2、X3、X4、X5和X6分別代表地下生物量、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、SOD和Cu2+含量。可見,以上6個指標對4種供試植物耐銅鎳性篩選具有指導作用,可作為其他耐銅鎳植物篩選的關鍵指標。

表1 銅鎳脅迫下各指標隸屬值及綜合評價

3 討 論

重金屬脅迫會阻礙植物的正常生長和生理生化反應,引起植株根系活力下降、株高和生物量降低、組織脫水、葉綠素減少、呼吸光合作用減弱、代謝紊亂等變化,這些變化均可導致植物體蛋白質性能和抗氧化系統酶功能的改變[13]。

根系作為直接接觸土壤的植物器官,會最先受到重金屬脅迫毒害,造成根系主根長度變短、一級側根和根毛數量減少、根系活力下降等,最終表現為地下生物量降低[20],影響根系對土壤養分和水分的吸收,進而導致植物株高、葉片相對含水量、地上生物量等降低[13]。因此根系形態可作為植物受重金屬脅迫的主要特征指標。趙娜等[21]研究顯示,玉米根系受鎳脅迫后生長變緩、根須變短、根毛變少、根系發達程度降低,最終表現為地下鮮質量下降。本研究表明,銅鎳脅迫下4種供試植物均表現為根系活力下降,地下生物量、株高、地上生物量、葉片相對含水量降低,根冠比也發生相應變化;此外,回歸分析得出地下生物量對植物耐銅鎳性能貢獻較大。因此,地下生物量可作為評價植物耐銅鎳性能強弱指標之一。

Cu是植物葉綠體色素的重要組成成分,可參與植物光合電子的傳遞,同時也是葉綠素合成過程中部分酶的催化劑,過量的Cu會抑制葉綠素合成和破壞光合器官,從而影響光合速率;而Ni可以延緩植物葉片衰老,使葉片保持較高的葉綠素水平[22]。因此,Cu2+含量可表征植物受重金屬污染時的光合特性[13]。本研究顯示,隨著銅鎳脅迫濃度的增加,4種植物葉片的葉綠素a和葉綠素b含量逐漸下降,類胡蘿卜素含量逐漸增加,葉綠體色素含量均降低。究其原因可能是植物體內高濃度的Cu破壞了葉片組織中的葉綠體結構,使葉綠素合成受阻,從而導致葉綠素a和葉綠素b含量降低;葉黃素是一種類胡蘿卜素,也是優異的抗氧化劑[23],其在銅鎳脅迫下會為阻止細胞氧化而不斷增加,使類胡蘿卜素含量上升,但這不足以抵抗細胞衰老和氧化,葉綠素的降解大于抗氧化色素的合成,進而導致葉綠體色素含量下降。因此,植物體內Cu2+含量也可作為植物耐銅鎳性能的評價指標。

重金屬脅迫時,植物會通過積累滲透調節物質(可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸)維持細胞滲透壓以減少傷害,其中可溶性糖可提高細胞保水和吸水能力,增加植物原生質的彈性;可溶性蛋白具有維持細胞滲透壓、調節代謝和提高抗性的作用[24]。張詩雯等[25]研究顯示,千屈菜(LythrumsalicariaLinnaeus)在重金屬銅和鉻脅迫下,可溶性糖和可溶性蛋白表現出一定的滲透調節抗性。本試驗中,4種供試植物可溶性糖和可溶性蛋白含量均隨銅鎳濃度增加呈先升后降趨勢,且均高于CK,說明植物為保護自身不受傷害而積累了可溶性糖和可溶性蛋白;此外,紫花苜蓿和鷹嘴紫云英表現出更好的耐銅鎳特性,其體內可溶性糖含量顯著增加時的脅迫濃度高于早熟禾和黑麥草,其可溶性蛋白總含量高于早熟禾和黑麥草。脯氨酸含量增加可增強植物對逆境的抵御作用,4種植物的脯氨酸含量隨銅鎳脅迫濃度增加而增加,且在高濃度時顯著增加,可能是可溶性糖和可溶性蛋白合成量減小所致,通過三者含量平衡消除重金屬對細胞的氧化損傷或維持胞內外滲透勢,表明脯氨酸有效抵御了銅鎳脅迫對植物的傷害[26]。結合線性回歸分析結果可知,可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量可作為植物耐銅鎳性能強弱的評價指標。

SOD是維持植物細胞氧化還原穩定的關鍵酶,其催化細胞內強氧化離子發生歧化反應生成氧化性較弱的H2O2,H2O2又在POD和CAT的作用下形成H2O,以減少氧化脅迫對植物的毒害作用,因此SOD起著抵御重金屬脅迫的先導作用[27]。趙會君等[28]研究顯示,Cu、Zn、Mn脅迫處理顯著增加了SOD同工酶條帶數量和SOD活性,SOD可作為植物耐受重金屬污染的重要生理指標。本研究表明,4種供試植物的SOD、POD和CAT活性均隨銅鎳脅迫濃度增加呈先升后降趨勢,其中POD和CAT活性峰值變化相同;而SOD活性峰值有所不同,表現為早熟禾、紫花苜蓿和鷹嘴紫云英SOD活性先于黑麥草達到峰值,說明4種植物的抗氧化系統產生適應性誘導反應的時間節點不同,有較好耐銅鎳脅迫能力植物的SOD活性增加時間早于耐受能力差的植物[29]。

土壤重金屬污染的植物修復是指富累積植物將金屬污染物吸收于自身體內,通過對其不斷地刈割和集中處理,將重金屬帶出土壤的過程[30]。重金屬脅迫下,植物各器官對重金屬元素的吸收能力有所不同,周婷等[31]研究表明,芹菜對鎳的富集能力表現為根系>地上部植株,李媛等[32]研究表明,Cu在小麥各器官中的質量分數表現為根須>麥葉>麥殼>籽粒>莖桿,Ni表現為根須>麥葉>麥殼>莖桿>籽粒。本研究表明,Cu2+含量在黑麥草、早熟禾體內表現為根>莖>葉,在紫花苜蓿、鷹嘴紫云英體內表現為葉>莖>根;Ni2+含量在黑麥草、早熟禾體內分別表現為莖>葉>根、莖>根>葉,在紫花苜蓿、鷹嘴紫云英體內表現為葉>莖>根,可見紫花苜蓿、鷹嘴紫云英對銅鎳具有較好的轉移能力。

4 結 論

植物耐銅鎳性與其形態特征和生理指標密切相關。回歸分析表明,地下生物量、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、超氧化物歧化酶和Cu2+對4種供試植物耐銅鎳性影響較大;隸屬函數綜合評價發現,4種植物的耐銅鎳性強弱表現為:紫花苜蓿>鷹嘴紫云英>草地早熟禾>多年生黑麥草。本結果可為耐銅鎳或超富集植物的篩選及銅鎳污染土壤的生物修復提供材料并進行推廣和應用。