細(xì)胞外囊泡在泌尿系腫瘤診斷中的研究進(jìn)展

金久凱，龐百仞，蔣軍輝

作者單位： 315211 寧波，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)部（金久凱）；寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院（龐百仞、蔣軍輝）

前列腺癌（PCa）、膀胱癌（BCa）和腎癌是最常見的三大泌尿系腫瘤，盡管目前早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的比例越來越高，但仍需要新的生物標(biāo)志物來提升泌尿系腫瘤的診斷效果。本文對細(xì)胞外囊泡（EV）不同亞型、表征方法、泌尿系腫瘤EVRNA標(biāo)志物及臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述，為未來泌尿系腫瘤診斷中應(yīng)用新的生物標(biāo)志物提供思路。

1 泌尿系腫瘤概況

1.1 PCa 近年來中國PCa患者顯著增加，2022 年預(yù)計死亡人數(shù)達(dá)56239 例[1]。前列腺特異性抗原（PSA）已被廣泛用于篩查PCa，但PSA敏感性特異性不強，早期檢出率較低。MRI 等影像學(xué)方法無法做到早期診斷。前列腺穿刺活檢即使采用多點活檢仍可能有較高的假陰性率。

1.2 BCa BCa 發(fā)病率及死亡率高居前列。膀胱鏡檢查是BCa 初步診斷的首選。細(xì)胞學(xué)檢查因其極高的特異性也是初始檢查的重要方式。核基質(zhì)蛋白（NMP22）、膀胱腫瘤抗原（BTA）等尿液標(biāo)志物和增強成像目前并未十分成熟[2]。

1.3 腎癌 腎癌絕大多數(shù)為腎細(xì)胞癌（RCC），死亡率為30%～40%，而PCa 和BCa 的死亡率約為20%[3]。早期RCC大多無癥狀，發(fā)現(xiàn)主要依賴于影像學(xué)檢查，目前暫無公認(rèn)的用于RCC 早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

1.4 其他 腎盂癌和輸尿管癌等上尿路尿路上皮癌（UTUC）并不常見，無創(chuàng)診斷方法也并未滿足臨床需求。

早期診斷泌尿系腫瘤可以顯著降低死亡率并挽救生命，然而現(xiàn)有的診斷策略并非令人滿意。因此研發(fā)一種高靈敏度和高特異性的方法來補充診斷泌尿系腫瘤迫在眉睫。

2 EV 及不同亞型

EV 是由各種細(xì)胞類型分泌的納米級細(xì)胞器樣膜囊泡，由磷脂雙分子層包裹，其含有核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，可動態(tài)參與細(xì)胞間通訊[4]。幾乎所有細(xì)胞都會釋放EV 到細(xì)胞外空間，它攜帶來自原始細(xì)胞的復(fù)雜生物信息，是以無創(chuàng)方式進(jìn)行腫瘤診斷的重要來源[5]。近來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞會釋放多種EV 亞型并具有不同的生物特性和生物學(xué)功能。本文采用大小劃分EV 并介紹了最新進(jìn)展，見圖1。

圖1 EV 不同亞型

2.1 大細(xì)胞外囊泡（lEV，直徑＞200 nm） lEV 根據(jù)自身特征可分為遷移體（500 ～3 000 nm）、凋亡小體（1 000 ～5 000 nm）和原癌小體（1 ～10m）。

2.1.1 遷移體 遷移體是在遷移細(xì)胞收縮纖維上形成的囊泡，其中還包含直徑50 ～100nm的小泡，因此也被稱為石榴體（PLS）。除了參與細(xì)胞遷移，它在穩(wěn)態(tài)維持、物質(zhì)傳遞、信號整合等方面也起重要作用[6]。

2.1.2 凋亡小體 凋亡小體是相對較大尺寸的泡狀小體，主要在細(xì)胞凋亡過程中產(chǎn)生。近年來發(fā)現(xiàn)它也參與細(xì)胞清除、組織穩(wěn)態(tài)、免疫等諸多過程[7]。

2.1.3 原癌小體 原癌小體是另一類腫瘤衍生的EV，其有著非典型的大尺寸及豐富的致癌內(nèi)容物，負(fù)責(zé)致癌信號的細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，并與PCa 密切相關(guān)[8]。

2.2 小細(xì)胞外囊泡（sEV，直徑＜200 nm） 外泌體是最具代表性的sEV，直徑30～150nm，通過傳遞核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等貨物來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)通訊[9]。Zhang 等[10]鑒定出兩個外泌體亞群：直徑為90～120nm的大外泌體（Exo-L）和直徑為60 ～80nm 的小外泌體（Exo-S），二者具有不同的分子特性，動物實驗表現(xiàn)出不同的生物分布，表明它們在細(xì)胞間通訊中可能具有不同的功能。

2.2.1 外泌顆粒 Zhang 等[10]首先提取了一種直徑35nm 的納米顆粒，命名為“外泌顆粒”。它與sEV 相比，表現(xiàn)出不同的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸譜，主要與肝臟中細(xì)胞融合，并可改變靶細(xì)胞的免疫功能。

2.2.2 超微粒 Zhang 等[11]鑒定了另一種細(xì)胞外納米顆粒，其從前述“外泌顆粒”的上清液中提取出，并被命名為“超微粒”。它在形態(tài)和分子上與外泌顆粒不同，在體內(nèi)顯示出更高的富集，并且富含多種潛在的生物標(biāo)志物，可能與癌癥有著緊密聯(lián)系。

3 細(xì)胞外囊泡的表征

3.1 表面等離子體共振（SPR） SPR傳感器代表EV表征中的一種新方法，具有無標(biāo)記實時檢測和少樣品處理的優(yōu)點。Min 等[12]開發(fā)了一種名為“nPLEX-FL”的納米等離子體傳感平臺，該平臺通過使用金納米孔提高靈敏度，對單個EV 上的目標(biāo)表面和內(nèi)部標(biāo)記進(jìn)行多重分析。Chen 等[13]報告了一種基于水凝膠-AuNP超分子球（H-Au）的SPR 生物傳感器用于分析PCa 衍生的EV，并在人血清分析中表現(xiàn)出較好的實用性。

3.2 EV 成像的顯微鏡技術(shù) 近年來用于EV可視化的顯微鏡技術(shù)取得了巨大進(jìn)步。Goughnour 等[14]通過實驗證明了冷凍電鏡與免疫金標(biāo)記相結(jié)合，提供有關(guān)EV攜帶特定分子的證據(jù)。Bairamukov 等[15]應(yīng)用AFM 技術(shù)來研究空氣和液體中不同EV亞型的納米力學(xué)特性，它們的顯著差異為正確區(qū)分EV亞型提供了新的支持。

3.3 電阻脈沖傳感（RPS） 可調(diào)RPS（TRPS）檢測通過納米孔顆粒的電阻來對EV 的尺寸和濃度進(jìn)行測量。改進(jìn)這項技術(shù)得到了微流控電阻脈沖傳感（MRPS），二者不同之處在于MRPS 使用的濾芯是剛性預(yù)校準(zhǔn)孔，而TRPS 使用的傳感孔可以拉伸以調(diào)整孔徑。Cimorelli等[16]開發(fā)了一種可重復(fù)的操作程序，應(yīng)用MRPS 探索測量粒徑分布的最佳稀釋劑和樣品稀釋度。

3.4 納米流式細(xì)胞術(shù)（nanoFC） nanoFC與傳統(tǒng)FC相比，較小的通道減少背景信號，較低的系統(tǒng)壓力增加顆粒的停留時間，從而增強信號的集成。Liu 等[17]通過nanoFC 同時實現(xiàn)單個EV（可低至40nm）的光散射和熒光檢測，分析結(jié)直腸癌和鼻咽癌細(xì)胞系單囊泡水平的EV-DNA，同樣該技術(shù)有望用于泌尿系腫瘤。

3.5 拉曼光譜（RS） RS是一種基于激光與分子振動相互作用的無標(biāo)記光譜，能夠在幾乎沒有預(yù)處理步驟的情況下分析樣品。Qian等[18]使用表面增強RS（SERS）來快速準(zhǔn)確地分析EV，發(fā)現(xiàn)血清衍生的EV診斷泌尿系腫瘤具有很高的準(zhǔn)確性。

雖然EV 表征方法取得了巨大進(jìn)步，但目前還無法做到精準(zhǔn)鑒別EV 及其亞型。對于高異質(zhì)性的EV 亞型及共分離的非EV 雜質(zhì)，現(xiàn)有表征方法易將其歸為一類，極大干擾后續(xù)EV 生物特性、所發(fā)揮的功能機制和工程化治療的研究。高效、快速地檢測和表征分析EV 的技術(shù)仍需探索。

4 泌尿系腫瘤診斷相關(guān)的EV RNA 標(biāo)志物

LI 等[19]指出血漿miR-141-5p 有希望區(qū)分PCa，曲線下面積（AUC）為0.652；對于miR-125a-5p，AUC為0.691；而二者比值A(chǔ)UC值為0.793，比單一應(yīng)用更合適。miR-217、miR-23b-3p、miR-30b-3p、miR-126-3p和circ_0044516 都有作為PCa潛在標(biāo)志物的能力[20-22]。Li 等[23]發(fā)現(xiàn)miR-375、miR-451a、miR-486-3p 和miR-486-5p 可用于區(qū)分PCa 與健康對照者。Gan 等[24]得出PCA3 聯(lián)合PSMA 是區(qū)分PCa 患者和健康者的最佳組合（AUC 為0.870）。ERG、PSMA、PCA3、CK19和EpCAM 在PCa 中也有診斷潛力。

研究發(fā)現(xiàn)lncLNMAT2、TERC、miR-19b1-5p、136-3p 及139-5p 可區(qū)分BCa 與健康對照組[25-27]。不同的RNA組合診斷性能優(yōu)于尿液細(xì)胞學(xué)檢查，可為診斷BCa 提供較高的敏感度和特異性[28-29]。Abbastabar 等[30]提出ANRIL 和PCAT-1 診斷BCa 時AUC為0.7229 和0.7292。El-Shal 等[31]指出miR-96-5p 和miR-183-5p 聯(lián)合診斷BCa 的敏感度為88.2%，特異性為87.8%，均高于獨自使用。Lin 等[32]驗證了miR-93-5p、miR-516a-5p 的BCa 診斷性能，AUC 為0.838 和0.790，也顯著高于尿液細(xì)胞學(xué)檢查（0.630）。

Xiao等[33]對RCC和健康個體的血漿衍生EV進(jìn)行高通量測序，揭示has-miR-92a-1-5p、has-miR-149-3p 和hasmiR-424-3p差異表達(dá)且具有診斷價值。miR-155和miR-224-5p作為尿RCC 診斷的EV 生物標(biāo)志物也有潛在價值[34-35]。

5 臨床應(yīng)用難點及解決方案

5.1 分離過程 因EV不同的理化特性，樣品預(yù)處理的標(biāo)準(zhǔn)化是EV 分離與檢測中的一大挑戰(zhàn)。臨床樣本中的EV 是一種目標(biāo)和非目標(biāo)EV 的混合物，不同分離技術(shù)得到的EV 不盡相同，也很難說哪種方法是最佳選擇[36]。此外，很難從生物體液中分離出純粹的EV，干擾物會影響樣品純度。因此，需要綜合考慮產(chǎn)量、純度和分離效率來選取最適合的EV 分離和表征方法。Tzaridis 等[37]建議將尺寸排阻色譜與超速離心相結(jié)合作為人血漿或血清生物標(biāo)志物研究的首選EV分離方法。Van 等[38]報告了一種“雙模式色譜”的新分離方法通過去除脂蛋白來提高EV 蛋白分析的準(zhǔn)確性。5.2 EV 的高度異質(zhì)性 從癌癥中釋放的EV 在大小、表面蛋白和其他成分方面都是異質(zhì)的，即便是從同一細(xì)胞釋放的EV 亞型也具有多樣性[39]。應(yīng)用單囊泡分析的單EV 研究是目前的最新研究方向，單囊泡檢測可進(jìn)一步明確單個EV 的特征。單EV 的功能及特性尚未完全明確，其較強的異質(zhì)性可能源于EV 生物發(fā)生的隨機機制[40]。Kim 等[41]使用基于“EV-Ident”的單囊泡分析方法來了解EV 異質(zhì)性，并成功鑒定出PCa EV 的三種不同尺寸亞型。

6 總結(jié)與展望

早期診斷泌尿系腫瘤是提高患者生存率和預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前以單囊泡分析為代表的新興檢測和分析方法在不斷揭示EV 的內(nèi)在特征，大量可能用于診斷泌尿系腫瘤的EV 生物標(biāo)志物也在不斷涌現(xiàn)，鑒于EV 在臨床方面的巨大潛力，EV 用于診斷泌尿系腫瘤或許并不遙遠(yuǎn)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突