稀有血型抗原基因分型多重PCR 體系的構建及應用

張繼偉，賀云蕾，俞露，鄧剛

作者單位： 315010 寧波，寧波市中心血站

1990 年以來，大部分血型系統的分子機制都已闡明[1]。Diego 血型系統Dia/Dib的等位基因的多態性來自外顯子19 上C2561T的突變，Dia等位基因編碼854 位上的亮氨酸（Leu），而Dib基因在854 位上編碼脯氨酸（Pro）[2-3]。血型系統的這一特征提供了血型抗原檢測的分子生物學基礎。序列特異性引物聚合酶鏈式反應（PCR-SSP）已被廣泛應用于稀有血型的定型中[4]。本研究建立了同時檢測低頻等位基因Dia、Cob并可進行5 份樣本混合檢測的多重PCR篩選體系。由于5 份樣本在單一反應管內同時檢測，篩選1 000 例樣本只需檢測200 次。其中陽性檢測結果[Di（a+）或Co（b+）]反應管中的5 例樣本再予以分別檢測，以確定其中的陽性樣本，得到Di（a+）或Co（b+）樣本后，進行分子測序驗證，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 收集2018-2021 年期間1000 例寧波地區獻血者血樣，血樣均為外周靜脈取血，EDTA抗凝。本研究經寧波市中心血站倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 DNA 抽提及混樣 根據天根全血DNA抽提試劑盒（天根公司，中國北京）說明書對血樣進行基因組DNA 抽提，紫外分光光度計測量其濃度。將5份DNA 樣本取少量混合作為多重PCR 反應模板。

1.2.2 建立同時檢測5 份樣本的多重PCR 體系根據低頻血型抗原等位基因Cob、Dia的SNP 位點設計序列特異性引物，見表1。優化反應條件建立多重PCR 篩選體系。25l 體系中，含有MgCl21.5 mmoL，1×PCR buffer，dNTP 200moL，等位基因Dia特異性引物dia-sm4h 和dia-as 各100 nmoL，等位基因Cob特異性引物Co-smh 和Co-ash 各100 nmoL，內參引物Bactin-S 和Bactin-AS 各50nmoL，DNA 模板100ng，以及Taq 酶0.625 U（TaqHS，TaKaRa，中國大連）。PCR 擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保持。通過混合基因型已知的DNA樣本，設置1 個陰性對照和3 個陽性對照模板，檢驗多重PCR 靈敏度和特異性。陰性對照為5 例D（iab+），Co（a+b-）型的DNA 混合樣本；等位基因Dia陽性對照為1 例D（ia+b+）樣本與4 例D（iab+）樣本的混合模板，等位基因Cob陽性對照為1例Co（a+b+）樣本與4 例Co（a+b-）樣本的混合模板；等位基因Dia、Cob的陽性對照為1 例D（ia+b+），1 例Co（a+b+）與3 例D（ia-b+），Co（a+b-）樣本的混合模板，陰陽性對照均含5 份DNA 模板，每份20 ng 共100 ng。

表1 擴增引物序列

1.2.3 樣本篩選 應用建立的多重PCR 體系進行樣本篩選，樣本為5 人份預混樣本約100 ng。擴增體系及條件同1.2.2。

1.2.3.1 多重PCR陽性結果的進一步檢測 由于多重PCR 中5 例樣本混合在一個反應管中檢測，為確定其中的具體陽性樣本，通過2 個單一PCR-SSP 反應進一步檢測多重PCR 陽性結果中的5 例樣本。多重PCR 中等位基因Dia陽性結果通過單一檢測等位基因Dia的PCR-SSP反應來進一步篩選，引物為Diasm4h 和Dia-as，及內參引物actin-S 和actin-AS；Cob陽性結果通過單一檢測Cob基因的PCR-SSP反應來進一步篩選，引物為Co-smh 和Co-ash 及內參引物actin-S 和actin-AS。以上兩個單一PCR 的反應體系和擴增程序均與多重PCR 一致。

1.2.3.2 測序驗證篩選到的稀有血型樣本 PCR方法篩選到的Di（a+），Co（b+）樣本進行測序驗證，測序反應擴增引物及方法參考Xu 等[5]之前的報道。

2 結果

2.1 多重PCR 篩選混合樣本的特異性 3 個陽性對照中低頻等位基因Dia和Cob的特異性條帶明顯，而陰性對照未出現相應條帶，因此建立的可同時篩選5 例樣本的多重PCR 體系具有良好的特異性，見圖1。

圖1 多重PCR 電泳圖

2.2 樣本篩選 應用建立的多重PCR方法，對1 000例寧波地區獻血者樣本進行篩選，共檢測了200 次（每5 例混合檢測），其中49 次結果為低頻等位基因Dia陽性，1 次結果為低頻等位基因Cob陽性。通過單一PCR-SSP 對多重PCR 陽性結果的5 例樣本一一檢測，從1 000 例樣本中確定了49 例Di（a+）樣本，1 例Co（b+）樣本，見圖2。

圖2 樣本篩選電泳流程圖

2.3 測序結果 PCR 方法篩選出的49 例Di（a+）樣本及1 例Co（b+）樣本與測序結果一致，49 例樣本為雜合型Di（a+b+）、1 例樣本為雜合型Co（a+b+），見測序圖3。

圖3 SNP 位點測序

3 討論

血清學方法是血型抗原的經典檢測方法，然而針對稀有血型抗原的抗體試劑不僅昂貴而且難以獲得，因此將血清學方法應用于稀有血型的大規模篩選難以實施。在研究人群中低頻血型抗原等位基因頻率或在人群中篩選稀有血型樣本時，通常采用的是分子生物學方法[6]。許多研究者常采用PCR-SSP（或多重PCR-SSP）方法來篩選稀有血型樣本[7-8]，然而這些方法在一個反應管中只能檢測一個樣本，因此十分耗時費力。本研究在多重PCR 方法的基礎上創新地結合了樣本混合檢測的方法，即在單個反應管內同時檢測多個樣本，實現了檢測通量的提高，也降低了檢測成本。

低頻抗原Dia、Cob在人群中的表達頻率很低，因此如果應用多重PCR 反應檢測單一樣本，電泳結果幾乎均為陰性，陽性結果比例極少，而且即使在單一反應管內同時檢測多例樣本，結果也多為陰性。通過建立可在單一反應管內同時檢測多例樣本的多重PCR 反應，可顯著降低檢測時間和試劑耗費。應用本研究建立的篩選體系，1 000 例樣本的檢測次數從1 000 次降低到450 次，其中包括多重PCR 反應的200 次以及單一PCR-SSP 反應檢測多重PCR 陽性樣本的250 次（49×5+1×5），降低了55%的檢測量。不難推斷，本研究建立的多重PCR 方法檢測的等位基因頻率越低，將越經濟有效，因為多重PCR 反應陽性結果中的5 例樣本將在隨后的PCR 反應中一一檢測。

本研究實驗流程中進行的PCR 檢測方法均設置有實驗對照。在多重PCR 方法中，血清學鑒定已知的Di（a+b+）及Co（a+b+）樣本用做陽性對照樣本。運用雜合子樣本而非純合子樣本作為陽性對照，更能有效驗證本實驗檢測的靈敏度，降低檢測樣本攜帶低頻等位基因Dia或Cob而未被檢出的概率。然而，稀有的缺失型樣本，如Di（a-b-）和Co（a-b-）不可避免地將被漏檢，而錯誤的判斷為常見型Dib/Dib或者Coa/Coa。盡管如此，本實驗方法仍然十分有益，因為在中國人群中缺失型等位基因至今鮮有報道，存在的可能性極低。由于幾乎所有的Di（b-）和Co（a-）個體的都來自Di（a+）及Co（b+）[9]，由于本研究樣本量有限未能篩選出Di（a+b-）及Co（a-b+）的獻血者，不過可以通過建立可同時檢測稀有血型抗原等位基因Dia和Cob的多重PCR體系，并結合多樣本混合檢測的篩選方法，加大樣本量的檢測，建立Di（a+b-）和Co（a-b+）的稀有血型庫為有Dib和Coa抗體的患者提供相配合的血液。

隨著基礎分子生物學科的發展，人類血型的分子生物學檢測方法也得到了迅速發展，包括單一PCR-SSP 反應，多重PCR-SSP 反應，DNA 微陣雜交技術，血型基因芯片技術等[10-11]。與單一PCR-SSP 反應和多重PCR-SSP 反應相比，本研究建立的方法可以明顯降低試劑，時間和人力耗費。盡管DNA 微陣雜交技術和血型基因芯片技術可實現高通量多位點檢測，然而最初的儀器投入和高額的試劑材料耗費并不是每個實驗室都有能力承擔的。總而言之，該多重PCR-SSP 聯合多樣本混合檢測的方法適用于大規模的血型篩選和檢測工作，具有經濟有效高通量的優點。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突