水飛薊賓糖基化衍生物對肝癌細胞凋亡和周期的影響

黃瑋瑋，孫晶晶，潘金明，莊思靜，姜曉杰，曹宇，席建軍，莊讓笑

作者單位： 310012 杭州，杭州市西溪醫院

水飛薊素是從水飛薊的種子中提取出來的一種黃酮木質素類混合物，水飛薊賓（SLB）是水飛薊素中最具藥理活性的成分，占水飛薊素總量的60%～70%[1]。SLB 具有抗氧化，維持細胞膜穩定的作用，被廣泛用于治療各種肝病[2-3]。藥理學研究顯示，SLB能夠通過抑制腫瘤受體型酪氨酸激酶（RTK）的活性，如抑制表皮生長因子受體1（EGFR）和胰島素樣生長因子1 受體（IGF-1R）及其下游信號分子的活化等途徑，對肝癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌及舌癌等具有良好的抑制作用[4-5]。SLB 還可增強化療藥物的療效及逆轉多藥耐藥（MDR）的發生[6-7]，但其較差的水溶性（溶解度為430 mg/L）、較低的吸收度和生物利用度（吸收率20%～50%）嚴重影響其臨床治療效果[8-9]。筆者前期課題利用藥物糖基化對SLB 進行結構修飾，得到其糖基化衍生物，見圖1。本研究擬探討SLB 糖基化衍生物對肝癌細胞凋亡和細胞周期的影響，報道如下。

圖1 SLB 糖基化衍生物結構

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人肝癌細胞LIXC-002，上海研卉生物科技有限公司產品。

1.1.2 主要試劑 SLB 衍生物（SLB-X2），浙江大學醫學院附屬杭州西溪醫院制劑室制作，純度≥99%。SLB，純度≥98%，購買于武漢克米克生物醫藥技術有限公司。胎牛血清購買于Hyclone 公司，青鏈霉素購買于Sigma公司，RPMI-1640 培養基購買于Rockville公司，胰蛋白酶購買于Gibco 公司，細胞周期試劑盒、細胞凋亡試劑盒購買于南京建成生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 FORMA 700 型超低溫冰箱（Thermo 公司），YC-300L 型藥品儲存柜（中科美菱低溫科技有限責任公司），SW-CJ-2FD型超凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司），3K15 型低溫高速離心機（Sigma 公司），BS224 型電子天平（北京塞多利斯儀器系統有限公司），Forma 3111 型水套式CO2培養箱（Thermo Electron company），Beckman DxFlex 流式細胞儀（美國Beckman 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將LIXC-002 細胞加入到含有青鏈霉素以及10%胎牛血清的RPMI-1640 完全培養基中，于37 ℃，5%CO2培養箱中培養。

1.2.2 分組 實驗分為空白對照組（Control）、SLBX2（3mol/L）組、SLB-X2（10mol/L）組、SLB-X2（30mol/L）組及SLB 對照組（30mol/L）。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 根據分組方式加入對應化合物于37 ℃，5%CO2培養箱中孵育24 h，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化30 s，加入完全培養液終止消化，800 r/min離心5 min，棄上清，每管加入0.5 ml 染色緩沖液重懸細胞，然后每管加入5l Annexin V-FITC 染液，輕柔吹打混合均勻后，加入5l Propidium Iodide，混勻，室溫條件下避光孵育15 min，然后上流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期 取對數生長期的細胞接種至6 孔板，用無血清的培養基孵育24 h 使細胞同步化，隨后按照分組方式加入對應化合物于37 ℃，5%CO2培養箱中孵育24 h，加入2 ml 0.25%不含有EDTA 胰蛋白酶消化，800 r/min，4 ℃，離心5 min，棄去上清，使用體積分數為70%的冷乙醇500l對細胞進行重懸，4 ℃固定過夜。800 r/min 離心15 min 收集固定細胞，用0.4 ml PBS 重懸細胞并轉至Tube 中輕輕吹打，加RNase-A 約3l 至終濃度約為50g/ml，37 ℃水浴消化30 min，然后加PI 約50l至終濃度約為65g/ml，在冰浴中避光染色30min，用300 目尼龍網過濾，然后流式細胞儀進行檢測。1.3 統計方法 數據采用Graphpad Prism 9（Version 9.4.0）進行分析與作圖，Adobe Illustrator 2022（Version 26.3.1）進行整理合圖。計量數據以均數±標準差表示，多組間比較采用F檢驗，多重比較采用Dunnett-t 檢驗。P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SLB-X2 對LIXC-002 細胞凋亡的影響 在給予SLB-X2 處理后細胞凋亡率明顯上升，不同濃度SLB-X2（3、10 及30mol/L）處理的LIXC-002 細胞凋亡率分別為13.22%、16.40%和21.24%。與空白對照組比較，細胞凋亡率顯著上升（t≥8.62，均P ＜0.05），且隨著濃度的增加凋亡率進一步上升。與SLB 組比較，相同濃度下，SLB-X2 上調凋亡率能力是SLB 的2 倍（t=11.45，均P ＜0.05），見圖2 和封三彩圖1。

圖2 細胞凋亡實驗結果

圖1 SLB-X2 及SLB 對LIXC-002 細胞凋亡的影響

2.2 SLB-X2 對LIXC-002 細胞周期的影響 與空白對照組比較，SLB-X2 組G0/G1、S 期的細胞數量顯著減少，而G2/M 期細胞數量顯著上升（t≥3.26，均P ＜0.05）；不同濃度SLB-X2 G2/M 期細胞數量為23.83%、28.03%、29.21%，提示細胞周期被阻滯于G2/M 期。與SLB 組比較，在相同濃度下，SLB-X2的細胞阻滯作用更強（t≥2.65，均P ＜0.05），見圖3和封三彩圖2。

圖3 處在不同細胞周期的細胞數量結果

圖2 SLB-X2 和SLB 對LIXC-002 細胞周期的影響

3 討論

2007 年索拉非尼被批準用于晚期肝細胞癌（HCC）患者的標準姑息療法[10]，然而索拉菲尼對胃腸道和皮膚產生的不良反應以及耐藥性使其臨床應用受到巨大影響[11]。除索拉菲尼外，其他細胞毒性的化療藥物，都因嚴重不良反應對臨床應用產生了巨大影響[12]，因此高效、低毒的植物藥在研發抗腫瘤藥物上有很大潛力。

藥物糖基化后糖基部分能夠通過增加溶解性、調節血漿半衰期和提高與作用位點結合的特異性來改變母體藥物的藥理活性，因此藥物糖基化成為藥物結構改造和修飾的常用手段。SLB 在治療肝臟疾病上已經有悠久的歷史，近年來其抗腫瘤活性備受關注[13]，然而生物利用率低抑制了SLB 的發展。本研究旨在將SLB 糖基化修飾提高水飛薊賓抗腫瘤活性，結果顯示SLB-X2 具有比SLB 更加優良的促凋亡活性。本研究檢測了化合物對細胞周期的影響，在給予不同濃度的SLB-X2 后，細胞被阻滯在G2/M期，相同濃度下，SLB-X2 的細胞阻滯作用也明顯優于SLB。研究表明，SLB 糖基化修飾后，其體外抗腫瘤活性得到明顯改善，對肝癌細胞的細胞周期以及凋亡都具有影響，在低濃度下其抗肝癌活性明顯優于SLB。

圖3 生存曲線圖

綜上所述，SLB 糖基化物SLB-X2 能夠抑制肝癌細胞的生長，阻滯細胞分裂增殖，誘導細胞凋亡，起到延緩或抑制腫瘤細胞惡性傳代的作用，其作用機制有待于進一步深入研究。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 黃瑋瑋、席建軍、曹宇：實驗操作、論文撰寫；潘金明、姜曉杰、莊思靜、孫晶晶：數據整理、統計學分析；莊讓笑：研究指導、論文修改、經費支持