體外共培養(yǎng)誘導人羊膜上皮細胞向軟骨細胞分化的初步研究

王康，智曉東，張玉強，張文景，王偉

作者單位： 315040 寧波，寧波大學附屬人民醫(yī)院（王康）；錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院（智曉東、張玉強、張文景、王偉）

骨關節(jié)炎（OA）的治療關鍵在于軟骨再生，但是目前藥物治療、物理治療對于早中期OA 的治療并沒有逆轉(zhuǎn)病程進展的確切療效[1]。近些年來，干細胞治療OA 的良好效果受到了普遍的關注[2]。常用的干細胞包括脂肪間充質(zhì)干細胞（ADMSCs）、骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）及臍帶間充質(zhì)干細胞（UCMSCs）等[3-4]，但目前仍存在著許多局限性。人羊膜上皮細胞（hAECs）是近年來在干細胞治療領域廣受關注的“種子細胞”之一[5]。hAECs 較其他干細胞取材方便、來源豐富、免疫原性低，且hAECs 具有非致瘤性，應用更具安全性[6-7]。雖然以往有研究通過添加各種誘導試劑成功誘導了hAECs 軟骨分化，但是這種誘導方法過程繁瑣，而且無法在體外研究移植hAECs 至關節(jié)腔后與軟骨細胞的相互作用[8]。而基于transwell 小室的共培養(yǎng)技術誘導方法具有操作方便、成本低和可建立研究兩種細胞相互作用模型的優(yōu)勢。本研究以hAECs為前體細胞，在體外培養(yǎng)條件下，定向誘導分化為軟骨細胞，以探討其在OA細胞療法上的應用前景，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料來源 人關節(jié)軟骨細胞購買于ProCell 公司，批號202102254。剖宮產(chǎn)后的羊膜收集自錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，并獲得倫理委員會批準。排除胎兒畸形，產(chǎn)婦先天性遺傳病，及甲型肝炎、乙型肝炎、HIV、梅毒等傳染病史，產(chǎn)婦術前簽署了知情同意書。

1.2 hAECs的原代分離、純化、培養(yǎng)以及傳代 用鑷子及直鉗將羊膜從胎盤鈍性剝離下來，0.9%氯化鈉溶液洗凈。用含100 U/ml 盤尼西林、100g/ml 鏈霉素的PBS 液200 ml 漂洗羊膜組織2 ～3 次，除去血細胞，2 h 內(nèi)處理標本。從PBS 中取出羊膜，瀝干多余水分，置于滅菌培養(yǎng)皿中，剪成3cm2左右，挪至10cm培養(yǎng)皿中。加入0.25%胰酶20ml，剪碎，轉(zhuǎn)移至細胞篩網(wǎng)中，用瓶底研磨10 min，37 ℃恒溫水浴鍋中消化30 min，用200 目鋼網(wǎng)過濾以去除組織塊。加入5 ～10 ml FBS 中和胰酶，收集細胞懸液。未消化的羊膜組織可以繼續(xù)用胰酶消化2 ～3 次。所有的細胞懸液，1200r/min 離心3min，棄上清，培養(yǎng)液重懸沉淀。臺盼藍計數(shù)，以1×105/cm2接種到直徑為10 cm 的培養(yǎng)皿中。置體積分數(shù)為37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h 后輕輕將未貼壁的細胞吸出，再接種于新培養(yǎng)皿中。在飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，48 h 后首次換液，待細胞達80%～90%融合時，用0.25%胰酶/0.02%EDTA 消化傳代培養(yǎng)。

1.3 免疫組化鑒定hAECs 取第3 代hAECs，將細胞稀釋至細胞濃度為2×107個/L，將1 ml 細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。24 h 后PBS 洗滌3 次，多聚甲醛固定，PBS 洗滌5 min；通透20 min，PBS 洗滌5 min×3 次。封閉，滴加一抗CK19（1∶1 000）或波形蛋白（1∶1 000），4 ℃過夜，PBS 洗滌5 min×3 次。滴加二抗（1∶100），孵育1 h，PBS 洗滌5 min×3 次。滴加DAPI 避光孵育5 min，PBS 洗滌5 min×3 次；封片，鏡下觀察。

1.4 流式細胞儀鑒定hAECs 取第3 代hAECs，將細胞濃度調(diào)整為1×105個/ml，離心，棄去上清液，將預先準備好的0.3%BSA 溶液加入EP 管中，每管200l，室溫密封30 min，棄上清，加入小鼠抗人單克隆抗體分化簇CD73、CD90、CD105、CD29、CD34、CD45、SSEA-4 和HLA-DR，4 ℃靜置20 min。上機檢測細胞表型，IgG-PE 作陰性對照。從10 000 個活細胞中獲取數(shù)據(jù)，并使用FCS Express 軟件分析結果。

1.5 軟骨細胞與hAECs 間接共培養(yǎng)體系的構建選擇0.4m 的24 孔板transwell 小室。實驗分為兩組，實驗組：在24 孔transwell 系統(tǒng)的上腔中接種4×104個自體關節(jié)軟骨細胞（ACs），在培養(yǎng)板中接種了1×104hAECs。對照組：在24 孔transwell 系統(tǒng)的上腔中接種4×104hAECs，在培養(yǎng)板中接種1×104hAECs。每組有3 個復孔。將孔板置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，每2 天更換一次培養(yǎng)基（含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基），誘導21d后行后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 hAECs 與ACs 共培養(yǎng)系統(tǒng)

1.6 甲苯胺藍染色 將1.5 中所述的hAECs 共培養(yǎng)21 d 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗滌3 次，40 g/L 多聚甲醛固定10min。PBS 洗滌3 次，0.1%甲苯胺藍工作液常溫染色30min。棄去染料，蒸餾水沖洗干凈，鏡下觀察。1.7 免疫組化染色 將1.5 中所述的hAECs共培養(yǎng)21 d 后，制作細胞爬片，40 g/L 多聚甲醛固定30 min后，PBS 清洗3 次，每次5 min；3%的H2O2避光室溫封閉30 min；蒸餾水洗3 次；封閉，置于濕盒；滴加適當濃度（1∶100）的一抗，4 ℃過夜；37 ℃復溫30 min，PBS 洗3 次，每次5 min；滴加生物素化二抗（1∶200），置于濕盒，37 ℃孵育30 min。滴加辣根過氧化物酶，孵育40 min。PBS 洗3 次，每次5 min；DAB顯色，蘇木精復染；體積分數(shù)1%鹽酸乙醇分色數(shù)秒，乙醇梯度脫水，封片，鏡下觀察。

1.8 Western-bolt 檢測軟骨細胞標志物 將1.5 中所述的hAECs 共培養(yǎng)21 d 后，棄培養(yǎng)基，用4 ℃預冷的PBS漂洗后，用Trizol 法提取蛋白質(zhì)，經(jīng)定量后取60g蛋白質(zhì)，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，顯影。COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 一抗工作濃度為l∶500，GAPDH 一抗工作濃度為1∶1 000，4℃孵育過夜。滴加二抗山羊抗鼠IgG（1∶1 000），室溫孵育2 h。加入A、B 液（ECL 系統(tǒng)）后化學發(fā)光，使用Quantity One 分析軟件（BIO-RAD公司，美國）進行蛋白條帶的定量分析，AU（area density）代表條帶的面積×熒光強度，以各種蛋白/GAPDH 的AU 比值代表各自蛋白的相對含量。

1.9 RT-qPCR檢測軟骨細胞標志物 將1.5 中所述的hAECs 共培養(yǎng)21 d 后，棄培養(yǎng)基。用4 ℃預冷的PBS漂洗后，依次加入RNA提取液、三氯甲烷、異丙醇及75%乙醇等，提取總RNA，并測量總RNA的純度和濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄反應體系進行逆轉(zhuǎn)錄，使用GAPDH 作為內(nèi)參進行PCR 擴增，95 ℃，預變性10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s 循環(huán)40 次，60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃制作熔解曲線。采用2-CT法計算ACs標志物COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 mRNA的相對表達量，引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.10 統(tǒng)計方法 使用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組比較使用Student’s t檢驗。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 hAECs的形態(tài)學觀察和鑒定 接種后2 ～3 d，細胞黏附在壁上，原代細胞（P0）呈現(xiàn)散在細胞團生長，具有很強的折射率，第3 代細胞（P3）hAECs呈現(xiàn)典型鋪路石樣的上皮細胞形態(tài)，見圖2a；免疫熒光染色顯示CK19 強表達，Vimentin 弱表達，見圖2b。流式細胞術檢測hAECs 表面標志物的表達，結果顯示CD73、CD90、CD105、CD29 和SSEA-4 呈陽性，CD34、CD45 和HLA-DR 呈陰性，見圖2c。

圖2 hAECs 鑒定

2.2 共培養(yǎng)后hAECs 形態(tài)學觀察、免疫組化和甲苯胺藍染色 誘導共培養(yǎng)21 d 后，對照組hAECs 無明顯變化，依然呈現(xiàn)典型的鋪路石樣改變；而實驗組中的細胞則處于軟骨形成分化階段，呈現(xiàn)散在三角形或多角形形態(tài)。免疫組化和甲苯胺藍染色顯示COL2 和AGGRECAN出現(xiàn)大量表達，而對照組無表達，見圖3。2.3 共培養(yǎng)后hAECs 中軟骨細胞特異性蛋白相對表達量 實驗組軟骨細胞特異性蛋白COL2、COL1、AGGRECAN和SOX9 表達量均明顯高于對照組（均P ＜0.05），見圖4。

圖3 共培養(yǎng)后hAECs 分化鑒定

圖4 Western-bolt 檢測共培養(yǎng)后hAECs 軟骨特異性蛋白COL1、COL2、AGGRECAN 和SOX9 的表達情況

2.4 共培養(yǎng)后hAECs 中軟骨細胞特異性mRNA 相對表達量 實驗組中軟骨細胞COL1 mRNA、COL2 mRNA、AGGRECAN mRNA 和SOX9 mRNA 表達量均明顯高于對照組（均P ＜0.05），見圖5。

圖5 RT-qPCR 檢測共培養(yǎng)后hAECs 中COL2 mRNA、COL1 mRNA、AGGRECAN mRNA 和SOX9 mRNA 的表達情況

3 討論

關節(jié)軟骨組織本身可以在一定程度上再生，包括軟骨細胞、軟骨基質(zhì)和彈性纖維，但再生過程緩慢[9]。有研究證明hAECs 可在特定環(huán)境下向結膜上皮細胞、肝細胞樣細胞、多巴胺能神經(jīng)元、角膜上皮細胞和腺泡細胞等分化[10]；另一方面，hAECs 來源廣泛，分離培養(yǎng)方法相對簡單，體外培養(yǎng)性狀穩(wěn)定，適合進行體外實驗及臨床實驗研究。

本實驗應用酶裂解法分離出hAECs，分離方法簡單易行，體外培養(yǎng)的hAECs具有較強的增生能力，多次體外培養(yǎng)傳代后增生能力和分化潛能也不會發(fā)生明顯的改變。本實驗提取的hAECs 呈現(xiàn)典型鋪路石樣的上皮細胞形態(tài)，免疫熒光染色顯示CK19 強表達，Vimentin 弱表達。流式細胞術檢測hAECs 表面標志物的表達，結果顯示CD73、CD90、CD105、CD29 和SSEA-4 呈陽性，CD34、CD45 和HLA-DR呈陰性，與以前的研究結果一致[11]。

本研究初步探討了ACs 通過transwell 小室相隔與hAECs 共同培養(yǎng)，誘導hAECs 分化為ACs 的可能性。本研究選擇第3 代hAECs 和ACs 進行下一步共培養(yǎng)，因為傳至第3 代的上皮細胞具有更快的增殖速率和更好的生存力，適合于誘導分化實驗。結果表明共培養(yǎng)21 d 時hAECs 呈現(xiàn)ACs 典型的三角形或多角形的形態(tài)，免疫組化和甲苯胺藍染色提示實驗組COL2 和AGGRECAN 表達相對于對照組明顯增高，Western-bolt 和RT-qPCR 分析顯示實驗組COL1、COL2、AGGRECAN和SOX9 相對于對照組明顯增高。本研究用于hAECs 和ACs 共培養(yǎng)的培養(yǎng)基是適合ACs 生長的特殊培養(yǎng)基，但對照組沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化，這表明hAECs 的軟骨轉(zhuǎn)化不是培養(yǎng)基引起的，很可能在共培養(yǎng)過程中分泌了一些誘導hAECs分化的物質(zhì)，它們提供的微環(huán)境可以促進hAECs的分化。本研究對進一步優(yōu)化體外誘導hAECs 向ACs 具有重要意義，并為相關實驗提供了研究模型。

本研究為軟骨組織工程研究提供了新的細胞來源；然而，仍需要進一步深入研究，如定向調(diào)控影響hAECs 向軟骨細胞誘導分化的各種因素，探究hAECs 修復軟骨組織的機制的基礎上結合支架材料、細胞因子等，保持促進與抑制定向分化維持動態(tài)平衡以及細胞移植的安全性、可行性和組織工程潛在的免疫原性等問題。因此，需要進一步深入研究，建立一套標準的干細胞治療體系，以期能更好的應用于臨床。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 王康：實驗設計、實驗操作、統(tǒng)計分析、論文撰寫；智曉東：實驗指導、數(shù)據(jù)整理；張玉強、張文景：細胞培養(yǎng)、實驗檢測；王偉：研究指導、論文修改、經(jīng)費支持