呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患兒血清miR-19a-3p和SOCS1的表達(dá)及臨床意義

趙敏 韓英俊 李崢 劉亞坤 譚華清

急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infection,ALRI)是全球兒童發(fā)病和死亡的主要原因之一,呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是嬰兒ALRI的常見病因,也是嬰兒出生1年后住院的常見病因之一[1]。RSV是一種全球性感染的、副粘病毒科呼吸道單鏈RNA病毒,可分為兩種不同的亞型:RSV-A和RSV-B[2]。臨床表現(xiàn)為流涕、鼻塞、咽痛、干咳等癥狀,嚴(yán)重者可影響到其它系統(tǒng)疾病,甚至造成患者死亡,在全球范圍內(nèi),RSV導(dǎo)致約3300萬例5歲以下兒童發(fā)生ALRI,導(dǎo)致320萬例患兒住院和5.96萬例患兒死亡[3]。早產(chǎn)兒、慢性早產(chǎn)肺病(chronic lung disease of prematurity,CLDP)或先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)兒童易發(fā)生重度RSV,且在兒科人群中,RSV可導(dǎo)致長期后遺癥,例如喘息和哮喘[4]。目前還沒有安全有效的使用產(chǎn)品應(yīng)用于RSV的臨床治療,對(duì)RSV感染的患兒快速識(shí)別并采取有效的預(yù)防措施可降低全球患兒的發(fā)病率和死亡率[4]。因此,尋找相關(guān)生物標(biāo)志物識(shí)別RSV,對(duì)臨床中RSV的診療有重要意義。微小RNA(micro-RNA)是一種包含20～22個(gè)核苷酸的小的非編碼RNA,可參與多種生理和病理生理過程,如細(xì)胞凋亡、增殖和分化等,其中miR-19a-3p可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)[5]。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling,SOCS)是一種細(xì)胞蛋白,可以抑制許多細(xì)胞類型的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),且SOCS1在調(diào)節(jié)炎癥方面具有重要作用[6]。但目前miR-19a-3p、SOCS1在RSV中的研究鮮有報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)旨在探究RSV患兒血清中miR-19a-3p、SOCS1的表達(dá)水平,為RSV的臨床研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

資料與方法

一、臨床資料

選取2019年1月—2022年1月在本院兒科接收的呼吸道感染患兒180例為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床確診為呼吸道感染[7];(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并支氣管畸形、惡性腫瘤、肺結(jié)核、支氣管異物、先天性心臟病、胸廓畸形、免疫缺陷、營養(yǎng)不良等疾病者;(2)肝腎功能不全者;(3)并發(fā)呼吸衰竭、心力衰竭者;(4)腦血管病患兒及缺血缺氧性腦病者。180例研究者中,將咽拭子RSV-RNA結(jié)果呈陽性的患兒(80例)作為RSV感染組,將RSV-RNA結(jié)果呈陰性的患兒(100例)為對(duì)照組。根據(jù)入院時(shí)Lowell評(píng)分[8]進(jìn)一步將RSV感染組分為重度組(Lowell評(píng)分≥10分,54例)和輕度組(Lowell評(píng)分<10分,26例)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(20180428)。

二、方法

1 臨床資料收集 采集研究者的性別、年齡、臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、氣促、喘息、嘔吐腹瀉等)、胸部影像學(xué)表現(xiàn)(紋理增多、散在斑片狀影、大片陰影等)等臨床特征資料。

2 血清細(xì)胞炎性因子的檢測 白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自武漢博士德生物公司,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。依據(jù)說明書程序依次加入樣品后,使用酶標(biāo)儀測量450 nm的吸光度值,計(jì)算血清中上述因子水平。

3 miR-19a-3p、SOCS1 mRNA表達(dá)檢測 取患兒體檢時(shí)早晨空腹靜脈血5 mL,血清保存于-80℃待測。使用TRIzol試劑(Thermo Fisher公司)提取血清中的總RNA,并用PrimeScript RT-PCR試劑盒(Thermo Fisher公司)反向轉(zhuǎn)錄。計(jì)算A260/A280比率以評(píng)估RNA質(zhì)量和純度。在推薦的熱循環(huán)設(shè)置下,使用480II RT-PCR系統(tǒng)(Roche, Basel, Switzerland)進(jìn)行qRT-PCR分析,步驟如下:95 ℃進(jìn)行一次初始循環(huán)(30秒),然后95 ℃循環(huán)55次(每次15秒),60 ℃循環(huán)20秒,72 ℃循環(huán)15秒。以U6、β-actin為內(nèi)參。基因相關(guān)序列(見表1)。反應(yīng)結(jié)束后相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 qRT-PCR引物序列

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、對(duì)照組、RSV感染組患兒臨床特征

兩組中的臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、氣促、喘息、嘔吐、腹瀉)和影像學(xué)胸片(散在斑片狀影)之間有顯著性差異(P<0.05)。且相較于對(duì)照組,RSV感染組患者血清中的IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著升高(P均<0.05)。而年齡、性別、病程、發(fā)病季節(jié)、影像學(xué)胸片(紋理增多、大片陰影)之間沒有顯著性差異(見表2)。

表2 對(duì)照組、RSV感染組患兒臨床特征

二、對(duì)照組、RSV感染組血清中miR-19a-3p、SOCS1水平比較

相較對(duì)照組,RSV感染組患者血清中的miR-19a-3p、SOCS1水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

表3 對(duì)照組、RSV感染組血清中miR-19a-3p、SOCS1水平比較

三、輕度組、重度組血清中miR-19a-3p、SOCS1水平比較

相較于輕度組,RSV重度組患者血清中的miR-19a-3p、SOCS1水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 輕度組、重度組血清中miR-19a-3p、SOCS1水平比較

四、血清miR-19a-3p、SOCS1與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

RSV患者血清miR-19a-3p與IL-6、TNF-α、IL-1β水平呈正相關(guān)(r=0.557、0.569、0.613,P均<0.05)。SOCS1與IL-6、TNF-α、IL-1β水平呈正相關(guān)(r=0.592、0.571、0.564,P均<0.05)。

五、血清中miR-19a-3p與SOCS1水平的相關(guān)性

RSV患者血清miR-19a-3p與SOCS1水平呈正相關(guān)(r=0.701,P<0.05)(見圖1)。

圖1 血清中miR-19a-3p與SOCS1水平的相關(guān)性的散點(diǎn)圖

六、血清中miR-19a-3p、SOCS1水平對(duì)RSV感染嚴(yán)重程度的診斷價(jià)值

以RSV患者血清中miR-19a-3p、SOCS1(具體值)水平為檢驗(yàn)變量,以RSV感染嚴(yán)重程度為狀態(tài)變量(輕度=0,重度=1)繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,RSV患者血清中miR-19a-3p、SOCS1水平及二者聯(lián)合預(yù)測RSV感染嚴(yán)重程度的AUC分別為0.714、0.735、0.851,其中聯(lián)合預(yù)測AUC顯著高于二者單獨(dú)預(yù)測AUC(Z二者聯(lián)合-miR-19a-3p=3.217,P=0.024)(Z二者聯(lián)合-SOCS1=3.679,P=0.048)(見圖2、表5)。

圖2 血清中miR-19a-3p、SOCS1水平預(yù)測RSV感染嚴(yán)重程度的ROC曲線

表5 血清中miR-19a-3p、SOCS1水平預(yù)測RSV感染嚴(yán)重程度的價(jià)值

討 論

RSV是一種多態(tài)性陰性單鏈RNA病毒,屬于肺炎病毒科,于1955年首次從患有呼吸系統(tǒng)疾病的黑猩猩中分離出來,是世界上嬰兒住院的主要原因,也是僅次于瘧疾的嬰兒死亡的第二大原因[9-10]。RSV主要通過密切接觸唾液或粘液飛沫傳播,病毒在鼻咽和上呼吸道的上皮細(xì)胞中短時(shí)間復(fù)制后,釋放的病毒顆粒轉(zhuǎn)移到下呼吸道的細(xì)支氣管或肺泡,發(fā)生免疫反應(yīng)導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤并縮小氣道,進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)支氣管炎等呼吸系統(tǒng)疾病[10]。一般來說,感染后大約3至7天,患者開始出現(xiàn)一些發(fā)燒、流鼻涕、鼻塞、咳嗽、咽癢、干咳等常見的癥狀[11]。研究發(fā)現(xiàn),RSV感染模式呈U形年齡曲線,5歲以下和65歲以上人群的發(fā)病率達(dá)到峰值。大多數(shù)兒童被認(rèn)為在2歲之前就接觸過RSV,且不會(huì)誘導(dǎo)終生免疫,因此會(huì)導(dǎo)致患兒反復(fù)被感染[9, 12]。全球內(nèi)每年約有3381萬嬰幼兒患有ALRI疾病,主要是由RSV引起,造成約5.96～19.9萬的患兒死亡,其中發(fā)展中國家死亡患兒占99%[7]。我國25%以上的ALRI住院患者被RSV感染,尤其在0～5歲嬰幼兒中,約有24%肺炎及40%～50%毛細(xì)支氣管炎是由RSV感染所致[7]。臨床上對(duì)RSV細(xì)支氣管炎的治療主要是支持性治療,包括適當(dāng)?shù)难a(bǔ)液和必要時(shí)使用輔助供氧,目前唯一批準(zhǔn)的抗病毒藥物是利巴韋林,但由于其潛在的毒性,使其在治療使用中受到限制[13]。盡管臨床中一直致力于對(duì)RSV疫苗的開發(fā),但目前尚無獲得許可的疫苗[12]。因此,尋求能反映RSV感染嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物,使RSV有望被及時(shí)防治,對(duì)提升患者的安全和健康方面有重大意義。

眾所周知,miRNA參與調(diào)節(jié)廣泛的生物活性,因此,miRNA最近已成為重要的臨床生物標(biāo)志物和治療工具[14]。例如,miR-29c、miR-30c、miR-193a-5p和miR-885-5p是人類T細(xì)胞白血病病毒1型診斷重要的新型潛在生物標(biāo)志物[15]。另一方面,在病毒感染期間,miRNA可能涉及感染的各個(gè)階段,其中miRNA介導(dǎo)的抗病毒活性已被報(bào)道用于登革熱病毒[16]。本研究結(jié)果顯示,在RSV患者血液中,miR-19a-3p水平顯著增高,且隨著疾病的加重進(jìn)一步增高,提示miR-19a-3p可促進(jìn)RSV的發(fā)生。與Fayyad-Kazan等[17]人在急性呼吸綜合征冠狀病毒2引起的冠狀病毒病實(shí)驗(yàn)中miR-19a-3p上調(diào),且血漿miR-19a-3p表達(dá)水平可作為SARS-CoV-2感染期間的潛在診斷生物標(biāo)志物結(jié)果一致。Zheng等[18]人也發(fā)現(xiàn),在RSV中miR-19a-3p表達(dá)水平顯著上調(diào),且RSV NS1可能通過miR-19a-3p激活5-LO和隨后的炎性細(xì)胞因子機(jī)制中發(fā)揮重要作用。此外,miR-19a-3p預(yù)測RSV嚴(yán)重程度的AUC為0.714,提示miR-19a-3p對(duì)RSV嚴(yán)重程度有一定的預(yù)測價(jià)值。在RSV小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),SOCS1被木犀草素下調(diào),且木犀草素通過調(diào)節(jié)miR-155/SOCS1/STAT1信號(hào)通路來抑制RSV的復(fù)制[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中,RSV患者血清中SOCS1水平顯著上調(diào),RSV重度組顯著高于輕度組,提示SOCS1可能在RSV中發(fā)揮促進(jìn)作用,與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。且SOCS1預(yù)測RSV嚴(yán)重程度的AUC為0.735,提示SOCS1對(duì)RSV嚴(yán)重程度有一定的預(yù)測價(jià)值。此外,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究表明,RSV患者血清中miR-19a-3p與SOCS1水平呈正相關(guān),且二者聯(lián)合對(duì)RSV嚴(yán)重程度預(yù)測的AUC和靈敏度高于單一預(yù)測,提示miR-19a-3p、SOCS1可能相互調(diào)節(jié),共同參與RSV的發(fā)生發(fā)展,且二者聯(lián)合對(duì)RSV嚴(yán)重程度預(yù)測的價(jià)值較高。

RSV感染的主要臨床表現(xiàn)是過度炎癥和組織損傷[20]。促炎細(xì)胞因子的釋放通常會(huì)引起過度的炎癥反應(yīng),主要包括白細(xì)胞介素IL-1β、IL-6、TNF-α,炎癥小體的激活對(duì)RSV感染有很強(qiáng)的影響[21]。Shen等[20]人研究表明大黃能夠減少RSV誘導(dǎo)的BALB/c小鼠血清和肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α因子的釋放。類似的,本研究結(jié)果也顯示出RSV患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)隨著疾病嚴(yán)重程度顯著上調(diào)。以上提示,RSV患者機(jī)體處于高度炎癥狀態(tài)。進(jìn)一步分析顯示,RSV患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均與miR-19a-3p、SOCS1水平呈正相關(guān),表明miR-19a-3p、SOCS1可能通過調(diào)節(jié)RSV相關(guān)炎癥反應(yīng),影響RSV疾病發(fā)展。在小鼠實(shí)驗(yàn)中,大黃抑制RSV感染小鼠的免疫炎癥反應(yīng),可能與通過NF-κB途徑抑制NLRP3炎癥小體激活有關(guān)[20]。IL-1β、IL-6、TNF-α可激活NF-κB途徑,而miR-19a-3p、SOCS1則被證明受NF-κB通路的調(diào)控[20, 22-23]。因此本研究推測miR-19a-3p、SOCS1在RSV疾病中可能通過激活NF-κB通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫炎癥,促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放,加重疾病進(jìn)展,然而具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述,RSV患者血清miR-19a-3p、SOCS1水平較高,二者聯(lián)合對(duì)RSV嚴(yán)重程度有較高的預(yù)測價(jià)值,可能通過促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放,加重疾病進(jìn)展。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較少,有一定的局限性,后期將使用隨機(jī)性大樣本量進(jìn)一步對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行深入研究。