宏基因組二代測序在免疫抑制患者肺部浸潤病因診斷中的應用

吳琴 王葆青 余榮環 黃潔

感染是免疫抑制患者最常見的疾病,病死率極高[1-2],其中肺是最常見的靶器官,肺部影像常表現浸潤陰影。免疫抑制患者出現肺部陰影的原因還包括化療藥物的使用[3](如利妥昔單抗[4])、腫瘤肺部浸潤和轉移、放射性肺炎、肺水腫等[5]。因此亟需一種快速精準的病原學檢測方法進行鑒別診斷。宏基因組二代測序技術(metagenomic Next-Generation Sequencing, mNGS)不依賴培養,具有廣而全的篩查特質[6]。對于難培養的微生物具有明顯優勢[7],同時也具有較好的陰性預測價值[8]。本研究通過對上海市徐匯區中心醫院呼吸與危重癥醫學科出現肺部浸潤的免疫抑制患者的一般資料、臨床特點、常規實驗室檢測及mNGS結果予以前瞻性分析研究,探究mNGS在出現肺部浸潤的免疫抑制患者病因診斷中的應用價值。

資料與方法

一、研究對象

前瞻性納入2019年11月至2022年11月間我科收治的出現肺部浸潤的免疫抑制患者60例。

二、納入和排除標準

1 納入標準:①年齡≥18歲。②所有患者均經免疫細胞計數檢測明確存在不同程度的免疫抑制。③入院時胸片和(或)胸部 CT提示肺部新出現浸潤陰影而病因診斷未明者。④入組前全身等部位無原發感染性疾病。

2 排除標準:①妊娠或哺乳期婦女。②合并精神異常者。③多臟器功能衰竭者。④mNGS等樣本未通過質量控制。

三、本研究獲得了上海市徐匯區中心醫院倫理委員會的批準[倫理編號:(2020)科審第(126)號]。所有患者或家屬均知情同意,并簽署了知情同意書。

四、研究方法

1 樣本的采集及處理 樣本采集:(1)肺泡灌洗液:根據患者肺部影像學,對于病變局限者,選擇病變部位引流進行支氣管肺泡灌洗;對于彌漫性病變者,選擇右肺中葉或左上葉舌段進行灌洗。(2)其它(血液、深部痰液、肺組織、胸水):部分患者經評估無法耐受或拒絕支氣管鏡時采集。

樣本處理:所有入組患者入院后,采集合適部位樣本按照醫院流程進行常規實驗室檢測,包括:血常規、C-反應蛋白(C-Reaction Protein, CRP)、微生物培養、涂片鏡檢(革蘭氏染色、抗酸染色、六胺銀染色)、γ-干擾素釋放試驗(interferon-γ release assay, IGRA)、血隱球菌抗原檢測、(1-3)-β-D葡聚糖檢測(Glucan, G)、半乳甘露聚糖檢測(Galactomannan, GM)、腫瘤細胞檢查(組織病理、流式細胞術、免疫組化)等。同時該樣本規范按照mNGS 送檢標本流程進行樣本核酸提取、文庫制備、文庫測序、序列與微生物數據庫比對的檢測。

2 mNGS陽性判定標準 參考mNGS在感染性疾病的專家共識[9]:(1)細菌(分枝桿菌、諾卡菌除外):檢出細菌(種水平)的序列數是其余所有細菌的10倍以上。(2)真菌:檢出真菌(種水平)的序列數是其余所有真菌的5倍以上。(3)結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB):至少檢出1條(種或屬水平)結核分枝桿菌復合群序列[10]。(4)非結核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria, NTM):檢出序列數(種或屬水平)在原始細菌列表排名前10位。(5)病毒:檢出序列數應至少覆蓋全基因組的 3 個非重疊區域。

3 病原體鑒定及臨床診斷 由有經驗的臨床專家結合患者臨床表現、常規實驗室檢測、mNGS結果及治療療效進行綜合診斷。

五、統計學處理

將納入研究的60例患者的檢測結果錄入 Excel 表格,并用SPSS 24.0 軟件分析。計數資料:統計例數和百分比;比較采用卡方檢驗或 Fisher 確切概率法。P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般資料及預后

研究共納入60例患者,平均年齡65.9歲,中位年齡67.0歲。疾病類型主要包括:血液系統疾病(彌漫大B細胞淋巴瘤6例、霍奇金淋巴瘤2例、慢性骨髓增殖性腫瘤1例、骨髓增生異常綜合征1例)、實體腫瘤(肺癌9例、食管癌9例、乳腺癌6例、結腸癌6例、鼻咽癌2例、膀胱癌、膽管癌、喉癌和胃癌各1例)、自身免疫病(干燥綜合征3例、類風濕性關節炎2例、抗中性粒細胞胞漿抗體(anti-neutrophil cytoplasmic antibodies, ANCA)相關性血管炎、混合性結締組織病、原發性腎上腺皮質功能減退癥、大皰性類天皰瘡、自身免疫相關性腦病各1例)、糖尿病和獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)患者。患者基本特征及預后(見表1)。

表1 患者基本信息及預后

二、mNGS檢驗效能及一致性分析

60例患者mNGS和常規實驗室檢測方法的陽性例數和陽性率分別為:mNGS:53例陽性,陽性率為88.3%;常規實驗室檢測方法:(1)涂片:16例陽性,陽性率為26.7%。(2)培養: 18例陽性,陽性率為30.0%。(3) G/GM試驗:3例陽性,陽性率為5.0%。(4)γ干擾素釋放試驗 /血隱球菌抗原檢測:5例陽性,陽性率為8.3%。(5)病理/流式:1例陽性,陽性率為1.7%。5種常規實驗室檢測方法的總體陽性率為55.0%,mNGS的陽性率與其相比差異有統計學意義(χ2=120.00,P<0.001)(見圖1)。

圖1 mNGS與常規檢測方法對比注:**表示兩組間比較P<0.01

一致性結果顯示(見圖2,表2):55.0%(33/60)患者樣本的mNGS檢測結果與常規檢測結果一致。(1)75.8%(25/33)患者樣本的兩種檢測結果完全一致,6例患者兩類檢測結果均為陰性,最終臨床分別診斷為2例脂質性肺炎,1例化學性肺炎,1例放射性肺炎,1例淋巴瘤肺內浸潤和1例結締組織病肺累及。19例患者兩類檢測結果均為陽性,14例為感染患者,責任病原分別為結核分枝桿菌5例、新生隱球菌2例、白色念珠菌2例、金黃色葡萄球菌1例、鮑曼不動桿菌1例和銅綠假單胞菌1例、Mycolicibacterium cosmeticum(非結核分枝桿菌之一)1例、馬爾尼菲藍狀菌1例。其余5例患者陽性結果均為定植微生物,均排除感染。(2)24.2%(8/33)患者樣本的檢測結果部分一致,部分一致的原因是由于mNGS額外檢出了常規檢測未檢出的病原微生物,其中3例額外檢出病毒,2例額外檢出細菌,2例額外檢出細菌和真菌,1例額外檢出真菌。

圖2 常規實驗室檢測方法與mNGS結果的一致性分析注:中間橙色表示檢測結果一致;中間藍色表示檢測結果不一致。左側33例(55%)為mNGS與常規檢測結果一致:75.8%(25/33)為兩種檢測結果完全一致,24.2%(8/33)由于mNGS的額外檢出與臨床檢測結果部分一致;右側27例(45%)為兩種檢測結果不一致:74.1%(20/27)mNGS陽性,常規檢測陰性,22.2%(6/27)兩種檢測陽性,但陽性結果不一致,3.7%(1/27)mNGS陰性,常規檢測陽性

表2 常規實驗室檢測方法與mNGS結果的一致性分析統計

45%(27/60)患者樣本的mNGS檢測結果與常規實驗室檢測結果不一致(見圖2,表2):(1)74.1%(20/27)樣本的mNGS檢測結果為陽性,而臨床常規實驗室檢測為陰性,最終17例根據mNGS檢測結果與臨床表現確診為感染。(2)22.2%(6/27)樣本的mNGS檢測陽性結果與常規實驗室檢測陽性結果完全不一致,6例患者中有4例通過mNGS檢測確診為感染(病原微生物分別為膿腫分枝桿菌、煙曲霉、耶氏肺孢子菌和鏈球菌)。(3)3.7%(1/27)樣本的mNGS檢測結果為陰性,而臨床常規實驗室檢測GM試驗陽性,患者最終確診為肺曲霉感染。

三、免疫抑制患者樣本病原譜分析

60例患者樣本共檢出126株病原體(見圖3),包括細菌62株,檢出前三位分別為鮑曼不動桿菌9株、副流感嗜血桿菌8株,金黃色葡萄球菌7株;真菌41株:耶氏肺孢子菌5株、念珠菌24株、曲霉9株、新生隱球菌2株和馬爾尼菲藍狀菌1株;分枝桿菌7株:結核分枝桿菌5株、非結核分枝桿菌2株;病毒16株。

圖3 mNGS檢出病原譜

四、病因分析

患者出現肺部浸潤的最主要原因為感染,共42名患者確診,占70.0%,其中混合感染11例,占感染患者總數的26.2%(11/42)。其它原因還包括化學性肺炎(5例,8.3%)、脂質性肺炎(2例,3.4%)、放射性肺炎(2例,3.4%)、淋巴瘤肺內浸潤(2例,3.4%)、結締組織病肺累及(2例,3.4%)、轉移性肺癌(2例,3.4%)、機化性肺炎(2例,3.4%)、肺腺癌(1例,1.7%)。確診為感染患者的白細胞和中性粒細胞值與非感染患者差異均無統計學意義(P>0.05),但CRP的t值為2.093,P=0.044(<0.05),兩者之間差異有統計學意義。

確診為感染的患者中有25例為細菌感染(包括5例結核分枝桿菌和2例非結核分枝桿菌),其中7例分枝桿菌mNGS全部檢出,5例抗酸染色陽性和(或)γ-干擾素釋放試驗陽性;17例為真菌感染(包括5例合并細菌感染),其中死亡率為29.4%(5/17),占本研究死亡人數的83.3%(5/6)。在尋找肺部出現浸潤的患者病因時mNGS的靈敏度為97.7%,特異度為52.9%,陽性預測值為84.0%,陰性預測值為90.0%。

討 論

目前臨床對于免疫抑制患者并發肺部浸潤陰影的早期診斷率低,多采用經驗性多種藥物抗感染治療,極易誘導細菌耐藥、延長住院時間、增加患者經濟負擔、加重臟器功能損害等。因此,早期選擇合適的病原學檢測方法,是對患者快速診斷、精準治療和決定預后的關鍵。mNGS在感染檢測方面具有極大的優勢,它直接從樣本中提取全部微生物的核酸進行高通量測序,提供詳盡的微生物圖譜,能夠有效的檢測肺部混合感染并縮短檢測時間[11],在血流感染[12-13]方面也有著比血培養更高的陽性率。對微生物診斷產生了革命性的影響[14]。

本研究通過將多種常規實驗室檢測方法與mNGS進行比較,結果顯示mNGS具備多方面的優勢。第一,mNGS對于感染的鑒別診斷明顯優于傳統檢測,尤其是在耶氏肺孢子菌和曲霉的檢測方面,傳統方法只檢出2例曲霉菌感染;第二,mNGS的陰性結果對于排除感染性疾病具有很大的價值,陰性預測值為90.0%;第三,在患者病因分析中,mNGS具有很高的靈敏度和較高的特異度,分別為97.7%和52.9%。

我們也發現免疫抑制患者肺部浸潤的最主要病因是感染(70.0%),其中40.5%(17/42)的患者為肺部真菌感染,如耶氏肺孢子菌肺炎(pneumocystis pneumonia, PCP)和侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)等。有研究報道急性淋巴細胞白血病或淋巴增殖性疾病患者PCP的發病率約40%[15]。而診斷為IPA的患者中,死亡率仍高達60%[16]。在本研究中真菌感染的死亡率為29.4%(5/17),占本研究全部死亡患者的83.3%(5/6),是造成患者死亡的主要原因。

由于本研究樣本量較少,也未進行RNA病毒的檢測,后續有待大樣本同時進行DNA和RNA測序的研究驗證mNGS在免疫缺陷宿主肺部浸潤的診斷價值。

綜合上述,免疫抑制患者肺部浸潤的病因診斷是對臨床工作者的重大考驗,選擇合適的病原學診斷方法尤為關鍵。對比傳統方法,mNGS作為一種有效的檢測手段,可提高肺部浸潤的免疫抑制患者的病原微生物檢出率,有效的區分感染與非感染,精準的診斷病因,從而指導抗感染藥物的應用、提升治療效果和改善預后。因此,mNGS在臨床精準診斷肺部出現浸潤的免疫抑制患者病因分析中有很高的應用價值。