miR-30a靶向ATG5軸調控自噬信號在支氣管哮喘中的作用

佘巍巍 孫天壽 龍成鳳 陳美宇 陳旭 廖覃雪 王明東

哮喘是一種高發的慢性肺部炎癥性疾病,發病率和死亡率逐年上升[1]。支氣管哮喘的病理特征為慢性炎癥,支氣管高反應性和氣道重塑[2]。支氣管慢性炎癥隨之而來的大量促炎細胞,致使支氣管痙攣收縮、粘膜水腫和粘液分泌,并最終驅動支氣管氣道重塑[3]。據報道,自噬基因ATG5的遺傳變異與促進氣道重塑和兒童哮喘中肺功能的降低密切相關[4]。自噬在氣道重塑中發揮重要作用,適當的自噬有助于逆轉纖維化進程,緩解支氣管哮喘氣道重塑[5]。miR-30a是編碼小RNA(miRNA)-30家族的一個成員。miR-30a參與不同細胞中Beclin 1介導的自噬過程的調節[6]。我們發現自噬相關蛋白ATG5與miR-30a存在潛在的結合關系。因此,本研究旨在探究miR-30a靶向ATG5軸調控自噬信號,參與哮喘中氣道重塑的發病機制。

資料與方法

一、動物、材料與試劑

使用6～8周齡SD雄性大鼠共24只,重量約(200±20)g(采購于成都達碩實驗動物公司),其生產許可證號為:SCXK (川) 2020-030。TGF-β1 ELISA試劑盒(貨號:ZC-39043, 茁彩)、VEGF ELISA試劑盒(貨號:ZC-38845,茁彩)、PDGF ELISA試劑盒(貨號:ZC-38897, 茁彩)、IL-4 ELISA試劑盒(貨號:ZC-37986,茁彩)、IL-13 ELISA試劑盒(貨號:ZC-37967, 茁彩)、Masson三色特染試劑盒(G1340-7×50mL, 索萊寶)、重組抗體LC3B(貨號:ab192890, abcam)、Beclin1(貨號:ab207612, abcam)、ATG5(貨號:ab108327, abcam)與β-actin(貨號:ab8226, abcam)均購于abcam公司。

二、主要儀器

電泳儀、超薄切片機、實時熒光定量(qRT-PCR)儀(北京君意東方電泳設備有限公司)、玻璃制刀機、徠卡組織處理機、透射電子顯微鏡(日本電子JEOL)、倒置生物顯微鏡(上海徠卡顯微系統貿易有限公司)。

三、研究方法

1 試驗分組及大鼠支氣管哮喘模型構建 隨機將SD大鼠分為4組,對照組(n=6),模型組(n=6),模型+NC agomir組(n=6),以及模型+miR-30a agomir組(n=6)。適應性飼養1周后進行支氣管哮喘模型構建,方法如下:大鼠第 1、8、15天分別腹腔內注射10 %卵清蛋白(OVA)和10 %氫氧化鋁的混合液1.0 mL進行致敏[5]。于OVA致敏后第21 天開始霧化激發,將大鼠置于一密閉玻璃容器中,給予4% OVA霧化吸入(霧粒直徑 3～5 μm),30 min/次,連續1周,以大鼠出現呼吸加快、口唇發紺、站立不穩等表現為模型構建成功。研究內容及方案符合實驗動物倫理原則,經桂林醫學院實驗動物倫理委員會審查并批準(GLMC202203253)。

2 miR-30a agomir給藥治療 于支氣管哮喘模型構建霧化激發起,模型+miR-30a agomir組大鼠與模型+NC agomir組分別在霧化前 1 h經氣管注射 20 μg miR-30a模擬物(miR-30a agomir)與 miRNA模擬物(NC agomir)。模型組和對照組給予相同劑量的0.9%氯化鈉液進行給藥。1 次/天,連續1周,在最后一次霧化后 24 h 內斷頸處死。

3 肺泡灌洗液采集及ELISA檢測 于最后一次霧化結束后處死大鼠,雙側肺臟PBS灌洗量為1.2 mL, 反復灌洗3～5次并收集灌洗液。肺泡灌洗液1500 rpm,4℃離心10 min,取上清。其肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4與IL-13的含量采用ELISA試劑盒來進行檢測定量。依據試劑盒生產廠家標準操作流程進行操作,于450 nm處測量各樣本吸光光度值。

4 HE染色觀測肺臟損傷情況 大鼠處死后,分別采集大鼠中段左肺,以10%的中性甲醛溶液固定。分級脫水后以石蠟包埋,常規切片為5 μm的薄片。烘干后,常規蘇木精-伊紅染色分析,以中性樹脂封固進行觀察。光學顯微鏡下以100倍,400倍觀察肺臟損傷。

5 肺臟膠原沉積觀察 采用Masson染色法進行染色,觀察肺臟膠原沉積。肺組織常規切片,脫蠟至水后按照生產廠商指示進行染色,最后以中性樹脂封固進行觀察。經過染色操作后,肌纖維及細胞質呈現為紅色,但是細胞核呈深藍色,膠原纖維呈現藍色。掃描藍色的膠原纖維所占面積,并統計膠原沉積所占百分比。選擇完整氣道,分別測量支氣管平滑肌層厚度(Md)、支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管管壁厚度(Wd)和平滑肌層面積(WAm)以及管壁總面積(WAt)。其結果將各標本組織基底膜周徑(Pbm)進行統一標準化(即分別使用Md/Pbm、WAm/Pbm、WAt/Pbm、Wd/Pbm指標來評估氣道重塑程度)[7]。

6 RT-PCR 法檢測miR-30a與ATG5表達 大鼠肺組織樣本分別以Trizol法提取總RNA,將總RNA逆轉錄為cDNA后實時熒光定量檢測各組miR-30a與ATG5的表達。引物序列如下所列:miR-30a引物,上游:5′-GATCTCGAGCTCAAGTAGGGGCATATCTGAACGAGGCT-3′,下游:5′-GATTATCGATAAGCTTCAATGCTATAACACATTTCTTTGC-3′[8]; ATG5引物,上游:5′-GCACCTCGGGTCCGAGGT-3′,下游:5′-GGCTCTGCTTCTCGTTCAGTTATC-3′;內參引物U6,上游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,下游:5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′[9]。反應條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,共35 個循環。2-△△Ct法計算每組miR-30a與ATG5基因的相對表達。

7 miR-30a agomir對肺泡自噬的影響 采用透射電鏡觀察肺泡上皮細胞自噬體的形成。送檢肺組織以3%戊二醛進行固定,采用透射電鏡觀察肺泡上皮細胞自噬體的形成。送檢肺組織以3%戊二醛進行固定。采用1%四氧化鋨進行再次固定,使用丙酮進行逐級的脫水,再用Ep812進行包埋,其半薄切片再用甲苯胺藍染色進行光學定位,然后采用鉆石刀做出超薄的病理切片,聯合枸櫞酸鉛和醋酸鈾進行染色,采用透射電鏡(型號JEM-1400FLASH)進行切片的觀察。

8 Western Blot 檢測各組大鼠肺組織中自噬蛋白 各組大鼠取左肺中段組織100 mg,勻漿后提取總蛋白,以BCA試劑盒測定蛋白濃度。取50 μg 蛋白質用于SDS凝膠電泳,電轉至PVDF膜封閉,一抗:LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG5孵育過夜后洗滌,二抗:孵育30 min,再次洗滌,ECL顯色。以β-actin為內參,定量LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1、ATG5表達情況。

四、統計學方法

結 果

一、哮喘大鼠肺組織中miR-30a與ATG5的表達水平

qRT-PCR分析結果顯示,與對照組相比,模型組大鼠肺組織中miR-30a表達下調,ATG5表達上調。與模型+NC agomir組相比,miR-30a agomir治療后,miR-30a表達上調,ATG5表達下調(見表1)。

表1 熒光定量PCR分析各組大鼠肺組織中miR-30a與ATG5的表達水平

二、各組大鼠肺組織病理損傷HE染色結果

對照組小鼠的切片HE染色結果為支氣管和肺泡的相應結構基本正常,無水腫和增生現象。和對照組小鼠的切片相比較,模型組小鼠的切片HE染色后肺泡間隔有較大的增寬,表現為肺泡上皮細胞和成纖維細胞增生,間質內有以中性粒細胞為主的炎性細胞浸潤。模型+NC agomir組氣管上皮細胞形態正常,有少量支氣管上皮細胞脫落,間質內有與模型組類似的炎性細胞浸潤。與模型組及模型+NC agomir組相比,模型+miR-30a agomir組無肺泡間隔增厚現象,無明顯支氣管上皮細胞脫落,間質內炎性細胞浸潤減少(見圖1)。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色(×400)A: 對照組;B:模型組;C:模型+NC agomir組;D:模型+miR-30a agomir組

三、miR-30a agomir治療對哮喘大鼠肺組織氣道重構與膠原沉積的影響

光鏡下Masson染色及統計結果可見,相較于對照組,支氣管哮喘模型組肺組織膠原纖維沉積顯著增多,而相較于模型+NC agomir組,miR-30a agomir治療明顯降低了膠原纖維在支氣管壁與肺泡壁的沉積。與Masson染色相吻合的是Wd、Md、WAt與WAm均顯示與膠原纖維沉積率相同的趨勢(見圖2,3及表2)。表明miR-30a agomir治療對支氣管哮喘導致的氣道重塑有明顯的減輕作用。

圖2 Masson染色觀察各組大鼠肺組織膠原沉積(×400)A:對照組; B:模型組; C:模型+NC agomir組; D:模型+miR-30a agomir組

圖3 膠原纖維沉積率統計結果注:與對照組相比,***P<0.001;與模型+NC agomir相比,###P<0.001

表2 miR-30a agomir治療對哮喘大鼠氣道重塑的影響

四、各組大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量變化

ELISA檢測TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量變化。在對照組大鼠血清中,TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13均呈低表達,而在支氣管哮喘造模后,其表達均顯著上調。與模型+NC agomir組相比,miR-30a agomir治療顯著降低了TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的表達。揭示了miR-30a agomir對纖維化與炎癥的抑制作用(見表3)。

表3 ELISA檢測TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量變化

五、miR-30a agomir治療對哮喘大鼠肺組織自噬的影響

為觀察miR-30a agomir治療對大鼠肺組織自噬的影響,透射電鏡用于觀察肺組織中肺泡上皮細胞自噬小體,WB用于檢測LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1的表達。(如圖4)所示,對照組大鼠肺泡上皮細胞自噬小體數量較模型組少,而相對于模型+NC agomir組,miR-30a agomir治療明顯減少了自噬小體的數量。與之吻合的是,LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比例、ATG5 和Beclin1均在哮喘造模后表達上調,而在miR-30a agomir治療后表達下調(見圖5,表4)。結果證明miR-30a agomir治療有助于靶向抑制ATG5表達并抑制肺組織過度自噬。

圖4 透射電鏡觀察肺泡上皮細胞自噬小體(×8000)A:對照組; B:模型組; C:模型+NC agomir組; D:模型+miR-30a agomir組

圖5 WB檢測各組大鼠肺組織LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1蛋白表達

表4 WB檢測各組大鼠肺組織LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1蛋白表達

討 論

微小核糖核酸(miRNA)是小于22個核苷酸和高度保守的調節性非編碼RNA[10]。以往的研究表明,miRNAs調節哮喘發生,并且是治療該病的潛在目標。Malmh?ll等人的研究表明,miR-155敲除后導致嗜酸性粒細胞炎癥和粘液分泌減少[11]。Collison等人證明,miR-145下調抑制了嗜酸性粒細胞炎癥、粘液過度分泌以及2型(Th2)細胞因子的產生[12]。在目前的研究中,miR-30a在哮喘大鼠肺組織中表達下調,ATG5在哮喘大鼠肺組織中表達上調,而miR-30a agomir的治療逆轉了哮喘導致的ATG5上調,表明miR-30a與ATG5存在靶向調控關系。

由于支氣管哮喘是一種長期的慢性炎癥,長期的慢性炎癥導致支氣管纖維化最終造成氣道狹窄,即氣道重塑[13]。支氣管氣道重塑的主要特征是氣道壁增厚、上皮下纖維化、平滑肌質量增加、支氣管粘液腺和毛細血管網生成增多[14]。降低炎癥,減少纖維化是治療支氣管哮喘、逆轉氣道重塑的指導方針。從病理結果與氣道重構評分結果來看,miR-30a高表達對改善哮喘大鼠的病情很有幫助,不僅降低肺泡上皮細胞和成纖維細胞增生,還減少了炎性細胞的浸潤,同時降低了膠原纖維在氣道的沉積,以及支氣管的厚度。與之吻合的是,ELISA的結果證實,miR-30a agomir治療降低了炎癥細胞因子IL-4及IL-13的表達。據報道,在哮喘模型中,過敏性氣道炎癥產生IgE,而IgE刺激肥大細胞以及嗜酸性粒細胞進一步分泌相應的細胞因子,包括IL-4、IL-5和IL-13[15]。此外,miR-30a agomir治療降低了TGF-β1、VEGF與PDGF的表達。據報道,TGF-β1、VEGF與PDGF三者均可由肥大細胞所表達[16]。其中,TGF-β1是一種促纖維化細胞因子[17];VEGF是血管生成的主要誘導因子,刺激滋養細胞增殖[18];PDGF作為免疫調節因子能促進成纖維細胞增殖[19]。三者均被認為在慢性哮喘中發揮重要作用,其降低提示miR-30a可抑制氣道纖維化,miR-30a可能成為支氣管哮喘潛在治療藥物。

在前期研究中,我們證實了miR-30a 有降低過敏性氣道炎癥與抑制氣道重構的作用,但其具體分子機制還未被證實。由于miR-30a agomir治療導致了氣道纖維化的抑制與自噬相關蛋白ATG5的下調。因此我們推測miR-30a對氣道重構的抑制作用與自噬有關。以前的研究資料表明,抑制ATG5介導的自噬可調節內質網應激和CD4+T淋巴細胞分化,進而逐步減小支氣管哮喘的氣道重塑以及氣道慢性炎癥[20]。而我們的研究發現miR-30a agomir治療抑制了肺組織的自噬,主要表現為自噬小體數量減少與蛋白ATG5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的下調。因此我們可以得出結論,miR-30a可能通過靶向抑制ATG5表達而減輕氣道自噬水平,從而減輕氣道炎癥,抑制氣道纖維化,達到抑制氣道重構的效果。本研究將對miR-30a治療支氣管哮喘的進一步研究奠定基礎。