北京市結核病防治機構復治結核病患者耐藥情況分析

張潔 齊紅偉 丁北川 楊新宇 任怡宣 樊瑞芳 田麗麗 李傳友 宋衛萍

復治結核病患者的耐藥率和死亡率均高于首次結核治療患者[1],據估計,復治結核病病例中的耐藥率比新發結核病例高5倍[2]。有研究表明,復治結核病患者的死亡率在4%～13%[3-4]。為實現世衛組織到2030年將結核病死亡人數減少90%的結核病戰略目標,解決復治結核病問題至關重要。復治結核病治療指南也改為基于藥物敏感性實驗的方案,首先需要掌握患者既往用藥史以評估患者是否耐藥,然后應盡快得到藥敏結果從而確定治療方案。本文首先對2017年1月至 2019年12月就診于北京市各個區縣結核病防治機構的復治結核病患者的臨床分離株使用分子線性探針技術快速篩查出耐多藥結核分枝桿菌菌株,之后對所有菌株進行比例法藥物敏感性實驗, 掌握其耐藥情況,從而為制定科學的診療策略提供依據。

資料與方法

一、實驗對象

本項目研究對象為2017年1月至 2019年12月本市16個區縣結核病防治機構所有復治肺結核患者的分枝桿菌陽性菌株,所有陽性菌株均在北京市疾病預防控制中心結核病實驗室樣本庫中冷凍保存,該研究已通過北京市疾病預防控制中心倫理委員會的審批(202208)。

對191例符合研究要求的分枝桿菌菌液使用PCR熒光探針法進行菌群鑒定,排除57例非結核分枝桿菌,納入134例結核分枝桿菌臨床分離株進行研究。通過查閱相關紙質病例及結核病監測電子數據庫從而確定患者的復治類型(復發/非復發)。

二、實驗方法

1 實驗材料及儀器 分子線性探針試劑由梅里埃診斷產品有限公司提供,核酸提取儀型號為博奧公司ExtractorTM36,結核分枝桿菌耐藥快速檢測系統為生物梅里埃GT-Biot48。

分枝桿菌中性羅氏培養基及含藥培養基由河南賽諾特生物技術有限公司提供,含藥培養基的含藥濃度分別為:異煙肼(INH)0.2μg/mL,利福平(RFP)40.0μg/mL,乙胺丁醇(EMB)2.0μg/mL,鏈霉素(SM)4.0μg/mL,左氧氟沙星(LFX)2.0μg/mL,阿米卡星(AK)30.0μg/mL,卷曲霉素(CM)40.0μg/mL,丙硫異煙胺(PTO)40.0μg/mL,對氨基水楊酸(PAS)1.0μg/mL。

2 分子線性探針藥敏實驗 分子線探針技術是將提取的DNA用生物素標記的引物進行多重PCR擴增和反向雜交。雜交步驟包括:擴增產物的化學變性、單鏈雜交、生物素標記的擴增產物與膜上的探針結合、嚴格漂洗、含有鏈霉抗生物素蛋白的堿性磷酸酶介導的染色反應。按照模板對結果進行判讀,當一個基因的所有野生型探針都能被檢測到,并且在被檢測區域沒有檢測到突變時,該樣本被認為對相應的抗生素敏感;如果發生突變,各自的擴增產物不能結合到相應的野生型探針,那么至少有一個野生型條帶缺失,或者出現了突變條帶,則該樣本被認為是耐藥的。

3 比例法藥敏實驗 按照《結核病實驗室檢驗規程》的標準操作程序對結核分枝桿菌進行比例法藥敏實驗。含藥培養基上菌落的生長數與對照培養基上菌落的生長數的比值為耐藥百分比,若耐藥百分比大于1%,判斷該菌株對該藥耐藥,反之則判斷為敏感。

三、相關定義

按照《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008年版)》復治結核病包括:(1)不合理或不規律使用抗結核藥物≥1個月的患者。(2)復發結核病患者。(3)初治失敗、死亡、轉移的結核病患者。

結核病復發是指過去有明確的結核病史,完成規定的化療療程后認為已治愈,之后檢查又出現結核菌陽性的肺結核患者。

多耐藥結核病(Poly-resistant tuberculosis,PR-TB ):對1種以上一線抗結核藥物產生耐藥(不包括同時對異煙肼和利福平耐藥)。

利福平耐藥(Rifampicin-resistant tuberculosis,RR-TB):對利福平產生耐藥。

耐多藥結核病(Multidrug-resisitant tuberculosis,MDR-TB ):至少同時對異煙肼和利福平產生耐藥。

準廣泛耐藥結核病 (Pre-XDR-TB) 由符合 MDR/RR-TB 定義、同時對任意氟喹諾酮類藥物耐藥的結核分枝桿菌菌株引起的結核病。

廣泛耐藥結核病 (Extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB) 由符合MDR/RR-TB 定義、同時對任意氟喹諾酮類藥物以及至少一種其他的A組藥物耐藥的結核分枝桿菌菌株引起的結核病。

四、統計學方法

用Excel 2010軟件收集記錄數據資料,應用 SPSS 22.0 軟件對數據進行統計學分析,計數資料采用χ2檢驗來比較組間差異,P<0.05 即差異有統計學意義。

結 果

一、分子藥敏結果

分子線性探針技術檢測134例結核分枝桿菌菌株中,76例對INH和RFP均敏感,單耐RFP 14例,單耐INH 4例,40例為MDR,MDR率為29.9%(40/134),95%CI(0.220～0.377)。

54 例RFP耐藥的菌株中,63.0%(34/54)在rpoB基因的S531L位點發生了突變,探針試紙條上顯示為野生條帶 WT8 缺失,突變條帶MUT3出現。1例菌株在rpoB基因D516V 位點發生突變,7例菌株在H526D位點發生突變。11例雖然野生條帶缺失但沒有相應的突變條帶出現的菌株被認為含有不確定或未知的突變。1例菌株表現為異質性耐藥突變模式,其探針試紙條上能觀察到所有的野生型條帶,但是一個突變條帶MUT1也出現了(圖1)。

圖1 異質性耐藥條帶注:樣本rpoB基因的野生型條帶WT1～WT8均顯色的同時突變條帶 MUT1也顯色,提示異質性耐藥

44例 INH 耐藥的菌株中,70.5%( 31/44)在katG基因 S315T1 位點發生了突變;22.7%(10/44)在inhA基因C15T位點發生突變。3例katG基因突變的菌株結果顯示野生型條帶缺失但沒有相應的突變條帶出現,表明有些未知的突變沒有被檢測到(表1)。

表1 分子檢測基因突變位點構成

二、不同復治類型患者的臨床特征比較

134例復治結核病患者中,58.2%(78/134)為復發患者,其他類型復治病例(非復發) 56例,占41.8%,按性別、年齡及地區不同進行統計,復發與非復發患者無明顯差異(P>0.05),復發和非復發患者對INH 和RFP的耐藥率差異無統計學意義(P>0.05),非復發患者的耐多藥率高于復發患者(39.3%vs23.1%),差異有統計學意義(χ2=4.090,P<0.05)。

表2 不同復治類型患者的臨床特征比較[n(%)]

三、復治患者臨床分離株比例法耐藥譜

對復治患者凍存的菌液傳代培養并進行比例法藥物敏感性實驗,菌株未生長、傳代失敗的29例,藥敏結果無法判讀的4例,最后101例菌株有完整的比例法藥敏結果,其中56例耐藥,總耐藥率55.4%(56/101)。101例菌株中復發患者菌株52例,耐藥率為57.7%(30/52);非復發患者菌株49 例,耐藥率為53.1%(26/49)。56例耐藥菌株的耐藥譜共有29種組合,其中耐多藥11種,準廣泛耐藥6種,廣泛耐藥1種;單一耐藥6種;多耐藥5種。具體耐藥譜(見表 3,4)。

表3 MDR患者耐藥譜

表4 復治患者其他耐藥類型耐藥譜

討 論

大量的研究表明,復治患者的耐藥率、耐多藥率都明顯高于初治患者[5-8],北京市2009—2010年復治肺結核患者臨床分離株對一線抗結核藥的耐藥率為56.4%,耐多藥率為28.2%[9]。北京胸科醫院的一項研究顯示2015年該院初治肺結核患者耐藥率為25.08%,耐多藥率為7.36%;復治患者的耐藥率為78.99%,耐多藥率為57.20%[10]。北京耐藥監測點的結果也顯示,復治患者的耐藥率為44.83%, 耐多藥率為34.48%[7],本次對北京市結核病防治機構復治患者的研究顯示,耐藥率為55.4%,耐多藥率為29.9%,其中,復發患者耐多藥率為23.1%,低于其他類型的復治患者。

本研究中,復發患者耐藥率為57.7%,高于上海市及寶雞市的研究報道[11-12]。結核病復發是指完成正確的療程并治愈的結核病患者體內又出現了活性細菌,可能通過再感染(外源性復發)或再激活(內源性復發)發生。然而,只有直接觀察給藥,才能確定患者已經完成了所有的藥物治療。如果治療沒有得到監督,復發的真實性就會受到質疑。一般來說,早期復發與內源性復燃有關,在進行正確的治療過程中,即使藥物達到了殺菌濃度,細菌芽孢也具有一定的生存能力。滯留菌不一定耐藥,但可能代謝緩慢或不規則,在免疫力低下的時候它們的代謝開始活躍并再次繁殖,導致了復發。因此,理論上復發患者會表現出與患者初治時相同的耐藥性模式,可以使用初始治療方案。如果在初次治療數年后復發,再次感染的可能性比內源性復燃的可能性大[13-14]。事實上,當實際進行藥敏實驗時,復發患者的耐藥性發生率與初治時候相比顯著增加。這可能是由于藥物攝入的不規律,也可能是由于單一或多重耐藥的選擇。

除復發病例外,大多數復治病例是由于之前治療方案實施或管理過程中的問題所致。其他類型的復治患者主要包括初治失敗、死亡、轉移的結核病患者以及不合理或不規律用抗結核藥物≥1個月的患者等。結核病治療失敗的原因可能是在治療的過程中,有一群具有代謝活性的菌群增殖[15],這為原始菌群中存在的自然耐藥突變菌的篩選創造了有利的條件,這種情況下實施藥物敏感性試驗就對治療方案的制定非常重要。不規則用藥的現象在患者治療過程中非常常見,不規則用藥持續數周或數月時,自然耐藥突變菌就有了發展的適宜條件。所以即便是在治療的最后幾個月,即使癥狀緩解,患者也必須繼續服藥。放棄治療的患者也分為不同的情況,一種是治療短時間內放棄所有藥物的患者,另一種是放棄其中一種或多種藥物的患者。放棄所有藥物的患者通常不會增加耐藥的風險,因為當患者接受治療時,藥物是有效的,而且沒有有利的條件來選擇自然耐藥突變菌,當治療中斷時,整個細菌種群恢復生長。因此,在這種情況下,重新采用最初的治療方案就足夠了。當病人在接受治療時放棄其中一種或多種藥物時,情況就完全不同了,這為選擇對患者繼續服用的藥物具有自發耐藥性的微生物創造了條件[16]。本研究共發現復治患者各種不同的耐藥組合29種,耐藥譜呈現出復雜性和多樣性。應根據藥敏試驗結果選擇合理的藥物組合,從而提高治愈率。

隨著結核分枝桿菌耐藥分子機制的闡明,快速的分子藥物敏感性試驗在臨床上應用越來越廣泛,本研究采用線性探針技術通過檢測rpoB基因的突變來判定對利福平的耐藥性;檢測katG基因確定對異煙肼的高水平耐藥,而檢測inhA 基因的啟動子區確定對異煙肼的低水平耐藥,從而快速篩出MDR。結果顯示,rpoB基因的S531L突變最為常見,占63.0%,而INH耐藥最常見的突變是katG基因的S315T位點,這與高水平的INH耐藥有關。對于僅發生inhA突變的患者來說,可選擇高劑量INH來進行治療,而當僅存在katG突變時,可使用乙硫酰胺進行替代治療[17]。

我們還鑒定出1例具有異質性耐藥突變的菌株,所有的野生型條帶都沒有缺失,且出現了一個突變條帶。異質性耐藥是指在同一臨床樣本中同時出現藥物敏感和耐藥菌株。異質性耐藥反映了結核分枝桿菌菌群從部分耐藥向全部耐藥轉變的中間過程。異質性耐藥對評估結核病治療方案和指導臨床用藥具有重要意義。當耐藥菌在菌群中的比例較低時,表型法藥敏結果為敏感,而針對敏感菌株的治療方案最后可能由于耐藥菌株的比例逐漸增加而治療失敗,目前對異質性耐藥的認識還不深入,針對異質性耐藥是否需要采取不同的治療措施還有待討論[18]。

綜上所述,北京市結防機構復治結核病患者耐藥率較高,特別是非復發的復治患者MDR率需要引起重視。對于復治結核病患者如果培養出陽性菌株應及時進行藥物敏感性實驗,從而盡早發現耐藥,并以此為基礎制定合理有效的治療方案。