應用二代測序技術初探順鉑在肺癌耐藥的相關機制

徐亮亮 廉政君 郭倩茹 陳存存 周明杰 陳志祥

肺癌(lung cancers,LC)嚴重危害人類健康[1]。由于肺癌臨床癥狀的不典型以及現有診療手段的局限性,大多數患者就診時已經是中晚期,喪失手術機會,所以化療仍然是肺癌治療的主要手段之一[2]。目前肺癌標準化療均是以順鉑為基礎的聯合方案,但耐藥性的出現仍然是順鉑臨床應用的重要限制因素[3-4],因此迫切需要識別和探索耐藥基因,從而逆轉順鉑耐藥。轉錄組測序可以在短時間內檢測出上千種基因表達,對藥物作用后組織或細胞功能性變化進行概括性描述。較多研究已證實PI3K/AKT/mTOR通路與藥物耐藥密切相關[5-6],抑制mTOR通路相關靶點,可以逆轉細胞毒藥物的耐藥性并達到聯合用藥協同增效作用[7],是提高化療敏感性的有效策略。

資料與方法

一、材料

收集2021年7月至2022年7月新疆醫科大學第八附屬醫院手術獲取的肺組織,共20例,其中10例為順鉑治療后未出現復發及進展的肺組織及癌旁組織,10例為順鉑化療過程中或應用順鉑化療后一年內出現局部復發或遠處轉移的患者,考慮為對順鉑耐藥。所有肺組織經病理明確診斷,患者均簽署知情同意書,研究方案經醫院倫理委員會批準[(2021)倫審003)]。

二、方法

1 轉錄組測序(RNA-seq) 分別抽取原發初治肺癌組織3例,復發性順鉑耐藥肺癌組織3例,提取組織RNA進行RNA-seq測序,RNA收集于凍存管內,立即放入液氮3～5秒速凍,并于-80℃冰箱保存,隨后放入干冰箱內寄于成都佩晨子生物科技有限公司進行數據監測及分析。

2 基因組富集分析(GSEA) 應用GSEA(https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)識別耐藥組織與非耐藥組織之間差異基因集。通過GSEA軟件(4.2.3版)富集RNA-seq檢測獲得的基因,參考基因集使用分子特征數據庫(MSigDB)中的50個標志性基因集(h.all.v2022.1.Hs.symbols.gmt)作為對照基因集,變化的數量被設定為1000次,P值小于1%和錯誤發現率(FDR)小于1%被認為具有統計學意義。

三、統計學分析

所有數據采用SPSS 19.0 和Graphpad prism 7.0軟件進行分析及作圖,組間率的比較采取Fisher確切概率法。所有統計學分析均以P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、肺癌患者的臨床相關性分析

對已收集的20例肺癌標本的患者臨床信息組間差異性分析,結果如(表1)所示,患者年齡、性別、病理分型和臨床分期之間的差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 肺癌患者臨床特征[n(%)]

二、通過RNA-seq測序分析耐藥組織與非耐藥組織間差異基因分析

本研究利用轉錄組測序對耐藥組織與非耐藥組織間差異基因進行分析檢測,具有統計學意義的差異基因有662個(FC >1.5,P<0.05)。為了確定在耐藥組織與非耐藥組織間被明顯激活的信號通路,利用GSEA軟件分析,根據P值<0.05選擇最明顯富集的信號通路,如(圖1)所示,四個通路發生重要改變:凋亡、DNA修復、NF-κB通路、PI3K-AKT-mTOR通路。

圖1 耐藥組織與非耐藥組織間基因組富集分析(GSEA)結果A:凋亡;B:DNA修復;C:NF-κB通路;D:PI3K-AKT-mTOR通路

三、信號通路中差異基因表達

對耐藥組織與非耐藥組織間轉錄組數據發現差異基因進行通路富集發現凋亡、DNA修復、NF-κB通路、PI3K-AKT-mTOR通路發生顯著改變,對通路中顯著差異變化基因進行挖掘,熱圖展示各通路變化基因(圖2),凋亡通路中CDKN1A、PRE1、GPX3、HMOX1、FASLG基因變化顯著,DNA修復通路中DDB2、RAD51、POLA2及NT5C3A基因發生顯著改變,NF-κB通路中CDKN1A、FASLG等基因以及PI3K-AKT-mTOR通路CDKN1A、DUSP5、DDX58、TRAE1等基因發生顯著變化。

圖2 熱圖展示各通路差異基因A:凋亡通路差異基因;B:DNA修復通路差異基因;C:NF-κB通路差異基因;D:PI3K-AKT-mTOR通路差異基因

四、基因本體論(GO分析)

根據差異基因進行信號通路富集分析,基因本體論(Gene Ontology, GO) 功能可用于對差異基因進行富集分析。GO功能分析發現血管內皮改變、凋亡及細胞黏附發生主要改變(圖3)。

圖3 GO功能分析耐藥組織與非耐藥組織間發生通路富集分析

討 論

順鉑耐藥的發生是肺癌治療失敗的主要原因之一。在本研究中,我們收集了初診為II～III期的非小細胞肺癌患者組織標本,患者術后行順鉑化療,化療期間出現病情進展的組織視為耐藥組織,1年內未出現復發及轉移的組織為非耐藥組織,對兩組組織進行轉錄組mRNA-seq測序,利用生物信息學方法深入分析原始數據,鑒定了顯著變化的差異基因,使用STRING網站來搜索發現細胞侵襲與遷移、細胞黏附和凋亡發生主要改變,耐藥組織具有更強的侵襲與遷移能力,細胞黏附與耐藥密切相關。

我們通過GO分析及基因組富集分析(GSEA)發現PI3K-AKT-mTOR-NF-κB 通路發生顯著改變。有研究發現新型抗腫瘤藥物化合物C與順鉑聯合用藥可以通過抑制PI3K-AKT-mTOR-NF-κB通路發揮協同抗卵巢癌作用,逆轉順鉑耐藥[8]。在多種惡性腫瘤中已觀察到順鉑可以誘導EGFR激活,其激活的程度可能影響癌細胞對化療的敏感性[9-11]。在EGFR的激活過程中,會發生EGFR二聚體化和多個酪氨酸的磷酸化,觸發PI3K/AKT/mTOR、NF-κB、STAT和RAS/RAF/MEK1/ERK1/2等通路的激活[12-13]。此外,順鉑誘導的NF-κB的激活導致順鉑耐藥,這在膀胱癌相關研究中已被證實[14-15]。PI3K/Akt通路在順鉑耐藥中起到重要作用,過度激活的Akt通路會下調腫瘤抑制蛋白,促進細胞異常增殖,抑制細胞凋亡從而導致腫瘤的發生。Akt的過度活化也能使高分化的結腸癌向低分化轉化,與腫瘤的不良預后有關[16],通過降低EGFR和NF-κB的激活水平,可以提高順鉑治療療效[17]。

綜上所述,本研究收集臨床組織標本后進行二代基因測序,利用GSEA富集分析發現,順鉑在肺癌中耐藥的機制可能與細胞較強的侵襲轉移等生物學過程,以及PI3K-AKT-mTOR通路有關。順鉑耐藥是由多因素多步驟所致,包括藥物在體內吸收和轉化的改變,藥效下降和藥物靶標的突變。轉錄組測序技術的應用,使我們能夠更有效地在功能上發現與順鉑耐藥相關的通路及基因。相關機制仍然需要進一步研究和大量實驗驗證。