局部應(yīng)用增生平水相提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性口腔癌預(yù)防作用的研究*

張紅利，馬兆峰，王嘉祺，孫正，關(guān)曉兵

口腔癌是臨床上較為常見的惡性腫瘤之一，其中部分由潛在惡性病變?nèi)缈谇话装吆图t斑發(fā)展而來[1]。而白斑和紅斑在組織病理學(xué)上通常伴有不同程度的上皮異常增生，這也是口腔黏膜癌前病變最基本的特征，是由正常上皮細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過渡階段[2]。如果能在這個(gè)階段使用藥物抑制口腔腫瘤的發(fā)生發(fā)展，即利用天然或合成的化合物阻斷、逆轉(zhuǎn)或延遲浸潤性癌的發(fā)生達(dá)到癌癥的化學(xué)預(yù)防作用[3]，這將是很值得研究的。

“增生平”是由山豆根、拳參、敗醬草、白鮮皮、夏枯草、黃藥子六味中藥組成的中成藥制劑。最初應(yīng)用于食管癌高發(fā)地區(qū)河南省林縣、河北省磁縣的食管癌前病變的阻斷治療并取得顯著療效，經(jīng)臨床觀察證實(shí)服用增生平3～5 年，可使食管癌前病變（重增）的人群食管癌發(fā)生率下降50%左右，有效控制了食管癌的發(fā)生[4]。

本團(tuán)隊(duì)一直致力于研究增生平對(duì)口腔癌的化學(xué)預(yù)防作用，在DMBA 誘導(dǎo)的金黃地鼠頰癌模型中，增生平灌胃組顯著降低了腫瘤數(shù)目及體積，抑制了口腔癌的發(fā)生，同時(shí)在4-硝基喹啉-1- 氧化物(4NQO) 誘導(dǎo)的小鼠舌癌模型中，增生平(10%膳食)也顯著降低了舌癌的發(fā)生率，由55.2% 降至22.2%。此外，在一項(xiàng)針對(duì)口腔白斑患者的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，ZSP 口服組與安慰劑組相比顯著降低了口腔病變的大小，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)增生平對(duì)口腔癌有很好的化學(xué)預(yù)防作用[5]。然而，長期口服使用增生平可能會(huì)引起嚴(yán)重肝毒性[6]。考慮到口腔解剖位置特殊，利于局部給藥，因此，將增生平改為局部用藥，可以提高用藥的有效性、安全性，減少藥物的用量，更加有利于藥物的治療效果。我們根據(jù)增生平的化學(xué)成分進(jìn)行提取、分析，保留藥物的有效成分，去除毒性部分，得到四種提取物甲醇相（methanol fraction），丁醇相（n-butanol fraction），水相（water fraction），乙酸乙酯相（ethyl acetate fraction），通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁醇相（n-butanol fraction）（4g/100ml）和 水相（water fraction）（1.4g/100ml），在口腔癌組織中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，腫瘤體積分別減少32.6%和22.9%[7]。本研究目的是為進(jìn)一步證實(shí)局部應(yīng)用低濃度增生平水相提取物對(duì)口腔癌依然具有良好的化學(xué)預(yù)防作用，以期獲得作用大、毒性小的口腔癌化學(xué)預(yù)防藥物。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 動(dòng)物模型的建立 本研究已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：KQYY-2012030301）。購入130 只雄性金黃地鼠（6～8 周齡、平均體重135 g），常規(guī)飼養(yǎng)1 周后隨機(jī)分為5 組。按照從增生平原藥中提取出的不同成分（甲醇相、丁醇相、水相、乙酸乙酯相）的比例，提取物水相原始濃度為1.4g/100 ml，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)水相提取物（1.4g/100 ml），在口腔癌組織中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，基于此劑量，我們依次降低水相提取物濃度，設(shè)置局部應(yīng)用增生平水相提取物低劑量組（0.35g/100 ml），中劑量組（0.7g/100 ml），高劑量組（1.4g/100 ml）各30只，陰性對(duì)照組10 只，陽性對(duì)照組30 只。陰性對(duì)照組不做任何處理，其余各組0.5% DMBA 溶液涂于地鼠左側(cè)頰囊，每周3 次，連續(xù)涂6 周后陽性對(duì)照組不再做處理，低、中、高劑量組涂抹相應(yīng)濃度的增生平水相提取物18 周。DMBA 誘導(dǎo)的地鼠頰囊口腔癌模型是經(jīng)典的動(dòng)物模型，一般在6 周時(shí)就會(huì)出現(xiàn)輕、中、重度異常增生（癌前病變）及原位癌（鱗癌的早期階段）的病理表現(xiàn)[8-9]，而本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)目的是研究藥物在癌癥發(fā)生的早期階段的阻斷作用，即癌癥的化學(xué)預(yù)防作用，因此設(shè)計(jì)在6 周后進(jìn)行藥物干預(yù)。

在實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 周時(shí)，斷髓處死動(dòng)物，取左側(cè)頰囊組織，首先觀察并記錄頰囊組織標(biāo)本的損害狀態(tài)，然后沿長軸縱向分割成兩部分，一部分固定在10%的福爾馬林溶液中，用于HE 染色及免疫組織化學(xué)染色；另一部分置于-80 度低溫冰箱中保存，用于western blotting 的檢測(cè)。

1.2 口腔腫瘤發(fā)生情況 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，記錄各組腫瘤發(fā)生情況、腫瘤數(shù)目及每個(gè)腫瘤的長、寬、高，取其平均值作為腫瘤半徑（r），計(jì)算各組平均瘤體積（瘤體積=4/3πr3，單位mm）

1.3 組織病理學(xué)觀察 頰囊組織固定于10%中性福爾馬林24 h 后取出，卷成筒狀，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，分切成5-6 mm 長的條狀，石蠟包埋，每個(gè)樣品切25 張4 um 切片，取第1、10、25 張進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察病理改變，并記錄不同病變數(shù)目。病理改變分為口腔黏膜上皮單純?cè)錾?、輕-中度異常增生、重度異常增生-原位癌和浸潤癌。上皮異常增生參照世界衛(wèi)生組織（WHO）（2005）分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[10]。

1.4 細(xì)胞增殖指數(shù)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束動(dòng)物處死前2 h 腹腔注射50 mg/kg 的5-氟脫氧尿嘧啶（BrdU，Sigma-aldrich 公司，美國）采用免疫組化Envision二步法檢測(cè)，在第2、9、24 張玻片上隨機(jī)選取正常黏膜、輕-中度異常增生，重度異常增生-原位癌和浸潤癌中的4 個(gè)區(qū)域，400 倍顯微鏡計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，作為BrdU 增殖指數(shù)即細(xì)胞增殖指數(shù)。

1.5 Bcl-2 蛋白表達(dá)的分析 利用western blotting檢測(cè)低溫冷凍保存的地鼠頰囊組織Bcl-2 蛋白的表達(dá)，將剪碎的組織裂解搖勻，4℃，13 000 rcf，離心10 min。取上清，上清即為總蛋白。用BCA 法計(jì)算蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳濕轉(zhuǎn)的方法完成蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，用β-actin 作為內(nèi)參蛋白完成抗原封閉及抗體雜交，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PVDF 膜上陽性信號(hào)制成膠片，將膠片掃描成圖像文件，用Gel-Doc 凝膠成像系統(tǒng)，通過Image J 圖形分析軟件計(jì)算單位光密度值和條帶面積，將各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的總光密度值與內(nèi)參比較，得到相對(duì)灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS18.0 for windows 統(tǒng)計(jì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用mean±SD 表示，檢驗(yàn)以a=0.05 作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

（1）采用秩和檢驗(yàn)（Rank-Sum Test）進(jìn)行不同組間平均瘤數(shù)目及平均瘤體積比較。（2）采用單因素方差分析（one-way ANOVA）檢驗(yàn)BrdU 增殖指數(shù)，LSD 兩兩比較。（3）采用單因素方差分析Bcl-2 蛋白的表達(dá)灰度值差異。

2 結(jié) 果

2.1 口腔黏膜腫瘤發(fā)生率及組織病理學(xué)分析 正常金黃地鼠頰黏膜為淡粉色、光滑、菲薄、有彈性，黏膜下血管清晰可見。實(shí)驗(yàn)第1 周至第6 周涂0.5%DMBA 期間，地鼠頰囊黏膜炎癥明顯，伴出血化膿。6 周以后，地鼠頰囊黏膜炎癥逐漸加重，部分地鼠頰囊可見增生物，為球形、乳頭狀或菜花狀，有蒂或無蒂，表面充血或有膿性分泌物，呈紅黃色相間狀，其中陽性對(duì)照組炎癥明顯比各用藥組嚴(yán)重，用藥組頰囊瘢痕攣縮明顯(圖1)。

圖1 腫瘤大體觀察情況

高劑量組和中劑量組肉眼腫瘤發(fā)生率由88.9%（陽性對(duì)照組）分別下降為78.9% 和83.3% (表1)。高劑量組顯著降低了上皮單純?cè)錾≡顢?shù)目（P ＜0.05）；低、中、高劑量組顯著降低了輕-中度異常增生的病灶數(shù)目（P ＜0.05）(表2、圖2)。

表1 腫瘤發(fā)生情況

表2 病理結(jié)果

圖2 病理結(jié)果

2.2 細(xì)胞增殖指數(shù) 低、中、高劑量組的細(xì)胞增殖指數(shù)在癌旁正常黏膜和輕-中度異常增生中與陽性對(duì)照組相比有非常顯著差異（P ＜0.01)，且中劑量組與高劑量組組間具有非常顯著性差異（P ＜0.01)。在浸潤癌中，中、高劑量組與陽性對(duì)照組相比具有顯著性差異（P ＜0.05)(表3，圖3)。

表3 細(xì)胞增殖指數(shù)

圖3 BrdU 增殖指數(shù)免疫組化結(jié)果（×400）

2.3 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平 低、中、高劑量組Bcl-2蛋白的表達(dá)較陽性對(duì)照組依次降低，中劑量組與陽性對(duì)照組相比，有顯著性差異（P ＜0.05)；高劑量組與陽性對(duì)照組相比，有非常顯著差異（P＜0.01)(圖4)。

圖4 Bcl-2 蛋白表達(dá)水平

3 討 論

增生平是一種傳統(tǒng)中藥，通過對(duì)其藥理研究發(fā)現(xiàn)，增生平有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和抑制食管上皮腫瘤發(fā)生的作用[11]。這與我們的研究結(jié)果是一致的，各用藥組在整個(gè)過程中炎癥反應(yīng)明顯較陽性對(duì)照組輕，進(jìn)一步證實(shí)了增生平的抗炎作用。此外，之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)氧化酶或5-脂氧合酶抑制劑作為抗炎劑，通過抑制異常的花生四烯酸代謝，阻止口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[12-13]。那么增生平水相提取物的抗癌作用是否也是由此通路實(shí)現(xiàn)，還需要進(jìn)一步研究。

肉眼觀察結(jié)果中，與陽性對(duì)照組比較，中劑量組及高劑量組肉眼腫瘤發(fā)生率由88.9%（陽性對(duì)照組）分別下降為83.3%和78.9%，雖無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但提示增生平水相提取物的局部應(yīng)用對(duì)腫瘤的發(fā)生是有抑制作用，并且有一定的劑量依賴性，濃度越大，作用越明顯。而前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)多為將增生平進(jìn)行地鼠頰癌模型灌胃或在小鼠舌癌模型中加入10%膳食[5]，這些模型可認(rèn)為是口服給藥的一種模式，而本實(shí)驗(yàn)考慮口腔解剖位置特點(diǎn)，設(shè)為局部給藥，創(chuàng)新了增生平用藥的方法并證實(shí)可行有效，為后續(xù)藥物轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

病理結(jié)果顯示，高劑量組顯著降低了上皮單純?cè)錾≡顢?shù)目（P ＜0.05）；低、中、高劑量組顯著降低了輕-中異常增生的病灶數(shù)目（P ＜0.05）。從結(jié)果上可以看出，增生平水相提取物對(duì)單純?cè)錾拜p-中度異常增生的作用較明顯，也就是癌癥發(fā)生的早期階段，這也正是化學(xué)預(yù)防藥物作用的適宜階段。

在化學(xué)致癌的過程中，細(xì)胞增殖被認(rèn)為可以促進(jìn)腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)階段，并且在腫瘤的促進(jìn)因子和非基因毒性的致癌物中發(fā)揮了重要作用[14]。由于不同部位的癌前損害是以細(xì)胞過度增殖為特征的，并且隨著異常增生的程度而加重，因此，細(xì)胞增殖標(biāo)記物有助于評(píng)價(jià)口腔癌前病變的程度和類型以及組織癌變的情況[15]。BrdU 是一種人工合成的核酸前體，是胸腺嘧啶類似物，可以被處于S期的細(xì)胞亞群經(jīng)由核酸旁路攝取，代替胸腺嘧啶整合入新合成的DNA 單鏈之中，因而檢測(cè)BrdU的陽性細(xì)胞率能反映組織細(xì)胞的增殖情況。由于BrdU 特異性的反映S 期細(xì)胞的活躍程度，因而對(duì)評(píng)價(jià)組織細(xì)胞的癌變潛力及預(yù)后也有重要的參考意義[16]。本項(xiàng)研究中通過對(duì)地鼠頰囊標(biāo)本中BrdU的陽性細(xì)胞率的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)隨著組織病損惡性程度的增加，BrdU 的陽性細(xì)胞率明顯增加，這就代表細(xì)胞增殖在相應(yīng)增加，提示細(xì)胞的異常增殖與口腔癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2004 年美國的一項(xiàng)體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)提示增生平是一種有效的肺癌化學(xué)預(yù)防藥物，可能是通過抑制細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞凋亡或兩者兼有達(dá)到預(yù)防效果[17]。本實(shí)驗(yàn)BrdU 增殖指數(shù)結(jié)果說明增生平提取物水相在癌癥發(fā)生早期階段發(fā)揮主要作用，可能也是通過遏制細(xì)胞的過度增殖，阻斷腫瘤的發(fā)生。不同濃度之間的作用效果也不同，說明增生平提取物水相對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用有一定的劑量依賴性。

腫瘤的發(fā)展是由于細(xì)胞的增殖和凋亡之間的平衡被打破。2012 年美國的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)ZSP 在體外抑制腦腫瘤生長，部分原因是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡完成[18]。Bcl-2 不僅是癌基因，也是重要的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑，它可以保護(hù)細(xì)胞拮抗凋亡。Bcl-2的升高可以使腫瘤細(xì)胞繞過生理性凋亡的正常調(diào)控機(jī)制，并且使這些細(xì)胞更進(jìn)一步地產(chǎn)生基因的改變，如c-myc 的擴(kuò)增、p53 的突變或激活其它的癌基因，從而使腫瘤的侵犯性進(jìn)一步增加[19-20]。

本次實(shí)驗(yàn)利用western blotting 檢測(cè)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示增生平提取物水相中、高劑量組明顯的抑制了Bcl-2 蛋白的表達(dá)，Bcl-2 蛋白表達(dá)的下調(diào)可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而抑制口腔癌的發(fā)生和發(fā)展。在低劑量組中，Bcl-2 蛋白表達(dá)也有所下降，且與中劑量組極為接近，說明增生平提取物水相可以抑制Bcl-2 蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，并且呈劑量依賴性，劑量越高，效果越明顯。

本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新了增生平在實(shí)驗(yàn)性口腔癌中應(yīng)用方法，證實(shí)局部應(yīng)用增生平水相提取物對(duì)口腔癌有一定的化學(xué)預(yù)防作用，但也存在很多局限性，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中我們更多的關(guān)注于癌變組織發(fā)生的病理變化，那么癌旁正常組織細(xì)胞的增殖和凋亡是否會(huì)因?yàn)樗幬锏挠绊懚l(fā)生改變呢，就需要我們進(jìn)一步的研究。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)基于前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在增生平水相提取物原始濃度（1.4g /100ml）的基礎(chǔ)上直接按二分法下調(diào)藥物濃度設(shè)置分組，未進(jìn)行有效濃度的梯度篩選也是本實(shí)驗(yàn)的一個(gè)很大的不足，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)增加濃度篩選過程，細(xì)化實(shí)驗(yàn)分組，最終篩選出最佳有效濃度。

4 結(jié) 論

局部應(yīng)用增生平水相提取物能夠通過抑制細(xì)胞增殖以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮腫瘤的化學(xué)預(yù)防作用，在口腔癌促癌及進(jìn)展階段時(shí)這種化學(xué)預(yù)防效果最為顯著且呈一定的劑量依賴性。