復方中草藥對運輸后肉牛應激蛋白mRNA和蛋白表達水平的影響

隋 明，吳亞楠

（1.四川工商職業技術學院，四川都江堰 611800；2.大慶市新科畜牧技術服務中心，黑龍江大慶 163000）

國內相關研究表明，應激的定義是由加拿大病理專家Selye 在1936 年首次提出的，所謂應激是指牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、狐貍、水貂等多種動物在生長過程中受到外界和內部的各種不同刺激（冷熱、運輸、噪音等）后，機體所產生的一系列應答反應的總稱（王莉梅等，2020）。臨床中常見的應激反應有冷熱交替、轉群、換料、噪音及運輸等，其中肉牛在運輸過程中出現應激癥狀較為多見，主要表現為體重、肉品質和免疫力下降，嚴重者可以導致急性死亡，同時可以引起一系列疾病，又稱為“肉牛運輸應激綜合征”（袁建彬等，2020 ；趙寧2020 ；王碧等，2017）。隨著我國肉牛養殖業的發展，養殖數量呈逐年上升趨勢，因肉牛運輸應激導致其發病、死亡或致殘現象普遍存在，運輸應激可對肉牛生產造成重大的經濟損失，嚴重影響我國肉牛養殖業的發展（劉楊等，2019 ；王曉娜等，2018）。當動物機體遭受多種應激源刺激時會產生一系列的應激反應，在應激源刺激過程中可以誘導機體產生具有不同生理功能的應激蛋白，尤其是熱應激蛋白（heat shock protein，HSP），在調控動物機體內外環境穩定起重要作用（鄭文亞等，2019 ；袁建彬，2019）。國內許多研究表明，中草藥富含多種生物活性物質，具有提高免疫力、抗氧化、抗應激等作用，被廣泛應用（楊冬英等，2016）。本試驗在肉牛基礎日糧中添加不同水平的復方中草藥后，模擬運輸應激，研究復方中草藥對肉牛應激蛋白mRNA 和蛋白表達水平的影響，進一步為肉牛應激中草藥研發及揭示抗應激添加劑的分子機理奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 當歸、黃芪、黃精、山藥、女貞子、枸杞子、玉竹等中草藥，購自北京同仁堂醫藥有限公司；血清中HSP 70 ELISA 檢測試劑盒，購自北京中控生物科技公司；Hsp 90、HSP 70 蛋白單克隆抗體、FITC 標記山羊抗兔抗體均購自由中國獸醫藥品監察所；組織RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、蛋白提取試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒，購自TAKARA 公司；SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、ECL 化學發光染料、BCA 蛋白定量試劑盒，均購自北京索萊寶生物科技公司；蛋白預染Maker，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 主要儀器 多功能凝膠成像系統、實時熒光定量PCR 儀（iQ5 型），美國Bio-Rad 公司產品；多功能全自動酶標儀，TECAN 公司產品。

1.1.3 試驗動物 40 頭健康的體重相近的荷斯坦育肥牛由本市規模化養殖場提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗采用單因素試驗設計（王曉娜等，2018），將40 頭健康、體重相近的荷斯坦育肥牛隨機分成4 組，每組10 個重復，分別為對照組（1 組）、0.5%（2 組）、1.0%（3 組）、1.5%（4 組）復方中草藥添加組，飼喂14 d 后進行運輸模擬，運輸條件為溫度：20℃，相對濕度：50%，運輸速度：60 km/h，運輸時間 5 h。

1.2.2 血清中HSP 70 含量檢測 采集不同試驗組肉牛運輸前、后的血液，離心分離血清，參照血清中HSP 70 ELISA 檢測試劑盒說明書進行測定。

1.2.3 組織中樣品的處理 試驗結束后每組隨意抽取5 頭試驗肉牛進行屠宰試驗，取其肌肉組織，參照組織RNA 提取試劑盒說明書提取組織總RNA，用反轉錄試劑盒反轉為cDNA，-80℃保存備用。

1.2.4 HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 蛋白mRNA 表達量的檢測 參考曹中贊等（2019）的方法，根據GenBank 中登錄的基因序列，設計牛的看家基因GAPDH 及HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 序列（見表1），由成都郝爾斯生物科技有限公司合成。參照組織RNA 提取試劑盒說明書提取組織總RNA 反轉為cDNA，以組織cDNA 為模板進行qRT-PCR反應，同時設立空白對照組，每個組織樣品設定3個重復。利用2-ΔΔCt法計算HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 基因的mRNA 表達量。

表1 牛的看家基因的基因序列

1.2.5 HSP 70 和Hsp 90 蛋白Western Blotting表達檢測 參照蛋白提取試劑盒說明書提取各試驗組肉牛肌肉組織中的蛋白質，用BCA 試劑盒檢測總蛋白量后，參照說明書進行SDS-PAGE 凝膠配制電泳和Western Blotting，用GelQuant 軟件分析HSP 70 和Hsp 90 目的蛋白和內參蛋白的表達量。

1.2.6 數據統計與分析 試驗數據用SPSS 18.0軟件進行統計分析，采用Duncan’s 法進行多重因素比較，試驗結果用“平均值± 標準差”表示，P＜0.05 表示組間差異顯著。

2 結果與分析

2.1 對肉牛血清中HSP 70 含量的影響 由表2可知，運輸后各組荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量均高于運輸前（P＜0.05），與對照組相比，試驗2、3、4 組運輸前后的荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量隨濃度增加呈下降趨勢，其中試驗2 組增加（P＞0.05），試驗3、4 組顯著減低（P＜0.05），3 個試驗組相比差異不顯著（P＞0.05）。添加不同水平的復方中藥可以降低運輸后荷斯坦育肥牛血清中HSP 70 含量。

表2 對肉牛血清中HSP 70 含量的影響

2.2 對模擬運輸后荷斯坦育肥牛HSP 27、HSP 70 和Hsp90 蛋白mRNA 表達量的影響 由表3可知，3 個試驗組運輸后的荷斯坦育肥牛肌肉組織HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表達量均低于對照組，其中與對照相比，試驗2 組運輸后的荷斯坦育肥牛肌肉組織HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表達量降低（P＞0.05），試驗3、4 組運輸后的荷斯坦育肥牛肌肉組織HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 的mRNA 的表達量顯著降低（P＜0.05），3 個試驗組相比差異不顯著（P＞0.05）。說明添加不同水平的復方中藥可以降低運輸后荷斯坦育肥牛肌肉組織HSP 27、HSP 70 及Hsp 90的mRNA 的表達量。

表3 對模擬運輸后荷斯坦育肥牛HSP 27、HSP 70和Hsp 90 蛋白mRNA 表達量的影響

2.3 對模擬運輸后肉牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表達量的影響 由圖1 和表4 可知，3 個試驗組運輸后的肉牛肌肉組織HSP 70 和Hsp 90 蛋白表達量均低于對照組，其中與對照組相比，試驗2 組運輸后的肉牛肌肉組織HSP 70 和Hsp 90 蛋白的表達量降低（P＞0.05），試驗3、4 組運輸后的肉牛肌肉組織HSP 70 和Hsp 90 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），3 個試驗組相比差異不顯著（P＞0.05）。說明添加不同水平的復方中藥可以降低運輸后肉牛肌肉組織HSP 70 和Hsp 90 蛋白的表達量。

圖1 模擬運輸后荷斯坦育肥牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表達量檢測結果

表4 對模擬運輸后肉牛HSP 70 和Hsp 90 蛋白表達量的影響

3 討論

肉牛在運輸過程中出現應激反應，又稱為“肉牛運輸應激綜合征”，運輸應激可以導致體重、肉品質及免疫力下降，嚴重者可能出現急性死亡，引起一系列疾病，給養殖業造成嚴重的經濟損失（王國艮等，2017）。相關研究表明，當動物因環境因素發生應激時，其機體可以通過調控其生理功能來維持內環境的相對穩定，同時可以激發染色體內的基因轉錄，合成具有特殊功能的蛋白質，即應激蛋白（heat shock protein，HSPs），動物體內HSPs 的合成可以通過多種途徑抑制動物體內其余蛋白質的合成（曹中贊等，2019）。相關研究表明，HSPs 廣泛存在于生物界中，該蛋白具有自我保護、自我防御等多種生物學功能，尤其是當外界發生不利因素時，動物體內的HSPs 大量合成，并且可以通過多種途徑與其他蛋白質發生結合，從而發揮機體自身保護作用，當外界出現不利因素，動物體內會引發應激反應時，機體內合成的HSPs會對機體細胞開啟自我保護模式，HSPs 可以作為應激指征（袁建彬等2019 ；鄭文亞等，2019 ；王曉娜等，2018）。因此，HSPs 在調控動物機體應激反應中起重要作用。HSPs 家族中包括HSP 27、HSP 70 及Hsp 90 等多種應激蛋白，其中HSP 70 蛋白是機體發生應激反應時生成量最多的應激蛋白家族成員之一，尤其是當外界應激源刺激時，其含量急劇升高（曹中贊等，2019 ；袁建彬等，2018 ；王國艮等，2017）。本試驗發現，模擬運輸應激可以使荷斯坦育肥牛血清HSP 70 含量和肌肉HSP 70 表達量明顯增加，荷斯坦育肥牛血清HSP 70 含量和肌肉HSP 70 含量升高可能與荷斯坦育肥牛機體對抗外界運輸應激帶來的危害有關。

研究表明，應激蛋白Hsp 90 可以與其他蛋白分子一同調節體內相關機能，尤其是在應激反應中，Hsp 90 含量變化與心肌梗死的發生有關（袁建彬等，2019 ；鄭文亞等，2019）。本試驗模擬運輸后肉牛肌肉組織HSP 27、HSP 70 和Hsp 90在mRNA 水平和蛋白表達水平均會增高。可能由于模擬運輸應激導致體內HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 含量及表達水平增加，在一定程度上可以緩解運輸應激對機體造成的損害，由于應激可導致肉牛自身營養消耗加快，快速合成大量應激蛋白，導致其應激蛋白增高。本試驗研究表明，在模擬運輸應激前飼喂復方中藥抗應激可以有效降低HSP 27、HSP 70 和Hsp 90 含量，有效緩解自身營養消耗，提高其機體抗應激能力，其作用機理有待進一步研究。因此，在肉牛運輸時可以應用抗應激添加劑來減少肉牛運輸應激綜合征的產生，提高畜體抗應激和保持機體穩態的能力。本試驗為抗肉牛應激中草藥研發及揭示抗應激添加劑的分子機理奠定了理論基礎。