基于非靶標代謝組學技術探討慢性腎臟病3～4期濕濁證患者的特征

鄭 鑫 鄧躍毅 李 芳 嚴夢婷 歸楚瀅 林 釤

(1上海市中西醫結合醫院,上海,200082; 2 上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎病科,上海,200320; 3 上海中醫藥大學,上海,200032)

中醫學中“證”的概念是疾病發展過程中某一階段的病理概括,可以反映疾病當前情況的本質。既往中醫對證的研究較為主觀,主要通過患者臨床表現及客觀體征,接診醫師進行相對主觀的判定,且診斷依據較為局限。鑒于血清及尿液代謝組學指標具有客觀性、先進性、整體性和前瞻性等優勢。本研究通過對慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)3～4期濕濁證患者血清及尿液代謝組學的研究,從整體代謝途徑的變化闡明CKD 3～4期濕濁證的本質。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6月1日至2019年12月31日上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎病科門診或住院收治的CKD 3～4期濕濁證患者60例作為觀察組,健康體檢者10例作為對照組,觀察組中男29例,女31例,年齡31～59歲,平均年齡44.82歲;對照組中男5例,女5例,年齡33～59歲,平均年齡43.30歲。所有入組患者均經臨床相關檢查確診,并自愿簽署知情同意書。本研究經上海中醫藥大學附屬龍華醫院醫學倫理委員會審批通過(倫理審批號:2018LCSY026)。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 CKD診斷標準,參照K/DOQI(Kidney Disease Outcome Quality Initiative)指南。指任何原因所致的腎臟病理學異常或血、尿、影像學檢查異常或腎小球濾過率(Glomerular Filtration Rate,GFR)的CKD-EPI公式:GFR<60 mL/(min·1.73 m2),并持續3個月,包括各類腎小球、腎小管間質或腎血管疾病[11]。

1.2.2 中醫辨證標準 參照國家中醫藥管理局醫政司2010年制定的《22個專業95個病種中醫診療方案》慢性腎衰竭的診斷標準中濕濁證的辨證依據。主癥:惡心嘔吐,肢體困重,食少納呆。次癥:脘腹脹滿,口中黏膩,舌苔厚膩。

1.3 納入標準 1)CKD 3～4期,估算GFR 15～59 mL/min,CKD-EPI公式計算;2)年齡在18～65周歲,男女均可;3)符合中醫辨證屬慢性腎衰濕濁證;4)符合CKD的診斷標準;5)自愿簽署知情同意書。

1.4 排除標準 1)診斷為急性腎損傷;2)合并心、腦、肝和造血系統等嚴重原發性疾病;3)CKD已經開始腎臟替代治療的患者;4)有嚴重的心力衰竭及合并感染患者;5)妊娠或哺乳期婦女;6)無法合作,依從性差者,如精神病患者。

1.5 研究方法

對照組于2019年12月30日清晨,空腹晨尿樣品。收集的尿樣品于室溫,3 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min,離心后提取3 mL上層尿液,分別裝于2支1.5 mL的EP管中,并滴入200 μL防腐劑,于-80 ℃冰箱中儲存。檢測前,樣品于冰水中解凍,在室溫下,3 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min,取上層尿液供檢測;同時留取血清樣品,對照組于2019年12月30日清晨,空腹采集全血樣品。收集的血樣品于室溫,3 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min,離心后提取3 mL血清,分別裝于2支1.5 mL的Ep管中,置于-80 ℃冰箱中儲存。檢測前,樣品于冰水中解凍,在室溫下3 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min,取上層血清供檢測。實驗檢測由上海百趣生物醫學科技有限公司完成。見圖1。

圖1 實驗流程

1.5.1 試劑與儀器 甲氧銨鹽(貨號:M0343)、核糖醇(貨號:C10046500)、吡啶(貨號:P111511)、甲醇(貨號:4.000306.4000)、氯仿(貨號:10071631)均購自阿達瑪斯試劑(中國)公司。氣相色譜儀器(Agilent公司,美國,型號:7890A);質譜儀(LECO公司,美國,型號:PEGASUS HT);色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)(Agilent公司,美國,型號:DB-5MS);離心機(Thermo Fisher Scientific公司,德國,型號:Heraeus Fresco17);超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific公司,德國,型號:Forma 900 series);烘箱(上海一恒科學儀器有限公司,型號:DHG-9023A);干燥儀(太倉市華美生化儀器廠,型號:LNG-T98)。

1.5.2 代謝物提取與上機檢測 首先取100 μL樣本于1.5 mL EP管中,加入10 μL尿素酶,37 ℃孵育1 h,后加入350 μL甲醇及10 μL核糖醇,離心30 s(尿液),有效離心半徑15 cm;取樣本50 μL于1.5 mL EP管中,后加入200 μL預冷甲醇及5 μL核糖醇,離心30 s(血清),有效離心半徑16 cm;超聲10 min;再將樣本4 ℃,12 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min;移取180 μL上清液于1.5 mL EP管中,每個樣本各取50 μL混合成質控樣本;后干燥提取物;再向代謝物中加入50 μL甲氧明鹽試劑,混勻后,80 ℃孵育30 min;在每個樣品中加入70 μL BSTFA,將混合物70 ℃孵育1.5 h;冷卻至室溫后,向混合的樣本中添加5 μL FAMEs;最后進行上機檢測。檢測條件為:進流量1 μL,Splitless Mode分流,3 mL/min隔墊吹掃流速,色譜柱:DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),1 mL/min柱流速,柱箱升溫50 ℃ 1 min,升至310 ℃(升高10 ℃/min)保持8 min,前進樣口溫度、傳輸線溫度均為280 ℃,電壓-70 eV,掃描速率:12.5 spectra/s,溶劑延遲:6.3 min(尿液),4.8 min(血清),離子源溫度:250 ℃,質量范圍m/z:50～500。

1.6 統計學方法 基于氣相色譜——飛行時間質譜聯用技術的代謝組學項目數據分析部分進行基礎數據分析是對代謝組的定性定量結果進行單變量統計分析和多元變量統計分析,篩選出現顯著差異的代謝物。數據分析內容主要包括:單變量統計分析:t檢驗;多元變量統計分析:主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析析(Orthogonal Partial least-squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)、差異代謝物篩選和鑒定及個性化(Receiver Operating Characteristic Curve,ROC)分析。數據處理采用ChromaTOF軟件(V 4.3x,LECO)對質譜數據進行分析。在物質定性工作中,使用了LECO-Fiehn Rtx5數據庫,將(Quality Control,QC)樣本中檢出率50%以下或RSD>30%的峰去除。見表1。試驗中使用的卡值標準是t檢驗的P<0.05,并且OPLS-DA模型的第一個主要成分的投影中的變量重要性(Variable Importance in the Projection,VIP)值>1。

表1 保留時間指數

2 結果

2.1 CKD 3～4期濕濁證患者尿液差異代謝物的篩選

2.1.1 PCA樣本全部處于95%置信區間(Confidence Interval,CI)內。見圖2。

圖2 全部樣本的PCA得分散點圖(散點數=70個)注:k.對照組;ssz.觀察組

2.1.2 OPLS-DA得分散點圖 對照組和觀察組的尿液OPLS-DA模型得分散點圖顯示組間差異有統計學意義(P<0.05),組內差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 全部樣本的OPLS-DA得分散點圖(散點數=70個)注:k.對照組;ssz.觀察組;與對照組比較,P<0.05

2.1.3 OPLS-DA置換檢驗 模型穩健性為67%,模型預測值為43%。見圖4。

圖4 觀察組對對照組OPLS-DA模型的置換檢驗結果

2.1.4 單變量統計分析,差異代謝物的篩選 進行差異代謝物篩選后顯示CKD 3～4期濕濁證差異性代謝物為:熊果苷,水楊苷、4氧代脯氨酸、胍基乙酸及肌酸。見表2。

表2 差異性代謝物篩選

2.1.5 個性化ROC分析 通過對照組對比觀察組5種差異性代謝物共70例樣本,進行個性化ROC分析,判定5種差異性代謝物對CKD 3～4期濕濁證的相關性分析。4氧代脯氨酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.69;胍基乙酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.757;肌酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.682;水楊酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.728;熊果苷與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.738。Total與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.940。見圖5。

圖5 5種差異性代謝物與CKD 3～4期濕濁證個性化ROC分析

2.2 CKD 3～4期濕濁證患者血清差異代謝物的篩選

2.2.1 PCA樣本全部處于95%CI內 見圖6。

圖6 全部樣本的PCA得分散點圖(散點數=70個)注:k.對照組;ssz.觀察組

2.2.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)得分散點圖 對照組和觀察組的血清OPLS-DA模型得分散點圖所示:組間差異有統計學意義(P<0.05),組內差異無統計學意義(P>0.05)。見圖7。

圖7 全部樣本的OPLS-DA得分散點圖注:k.對照組;ssz.觀察組

2.2.3 OPLS-DA置換檢驗 模型穩健性為70%,模型預測值為50%。見圖8。

圖8 觀察組對對照組OPLS-DA模型的置換檢驗結果

2.2.4 單變量統計分析,差異代謝物的篩選 進行差異代謝物篩選后顯示CKD 3～4期濕濁證差異性代謝物為:丙酮酸(Pyruvic Acid)、琥珀酸半醛(Succinate Semialdehyde 2)、富馬酸(Fumaric Acid)、檸檬酸(Citric Acid)、蘋果酸(l-Malic Acid)及Α珀酮戊二酸(Alpha-Ketoglutaric Acid)。見表3。

表3 差異性代謝物篩選

2.2.5 個性化ROC分析 通過對照組對比觀察組6種差異性代謝物共70例樣本進行個性化ROC分析,判定6種差異性代謝物對CKD 3～4期濕濁證的相關性分析,蘋果酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.808;丙酮酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.888;關性酮戊二酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.812;檸檬酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.948;富馬酸與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.717;琥珀酸半醛與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.853。Total與CKD 3～4期濕濁證的相關性的AUC值為0.738。見圖9。

圖9 6種差異性代謝物與CKD 3～4期濕濁證個性化ROC分析結果

3 討論

3.1 尿液代謝組學在CKD中的應用 代謝組學概念最早見于1999年由NICHOLSON等[1]提出。代謝組學的研究方法與中醫診治疾病的整體性、動態性相一致,為中醫學中“同病異治”及“異病同治”的理念提供新的研究方向。代謝組學的研究近年來受到國內外的密切關注,并已成為研究疾病變化的熱點。在腎病的領域中,代謝組學的應用也逐漸增多,腎臟是影響人體代謝的重要臟器之一,且人體尿液樣本采集相對容易且無創,并能較好反映腎臟病變情況,所以尿液代謝組學的研究在腎病的應用越來越廣泛。目前中醫藥干預CKD的尿液代謝組學研究已經進展了一部分,錢鵬等[2]研究發現,機體內核糖酸、L-阿卓糖、肌醇、丙酸、己糖醇、2-甲氧羰基-3-甲基-3-丁烯酸甲酯、D-呋喃木糖、廿二烷等的變化與CKD的診斷具有相關性。李仁武[3]、陳明[4]通過超高效液相色譜串聯飛行時間質譜的代謝組學研究技術對CKD肝腎陰虛證與脾腎虧虛患者證尿液的研究發現,2組證型患者體內反-2-順-4-癸二烯酰肉毒堿、苯乙酸、N-乙酰胱硫醚、β-單酰甘油、4-羥基苯乙酰谷氨酰胺、α-羥基馬尿酸、N-庚酰甘氨酸、苯丙酮酸、L-β-天冬氨酰-L-丙氨酸、α-天冬氨酰-賴氨酸、丁酰肉毒堿、泛酸、戊酰肉堿、3-氧代十六烷酸、N-乙酰-a-神經氨酸、9-癸烯酰肉毒堿、法尼半胱氨酸、S-羥甲基谷胱甘肽的差異有統計學意義,可以用來診斷CKD的2個不同的中醫證型。馮琴等[5]通過應用磁共振成像(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)對CKD晚期患者尿液的代謝組學研究發現:在CKD患者尿液中牛磺酸、枸櫞酸鹽、5-羥脯氨酸顯著下降,鳥苷酸乙酸酯、谷氨酸、N-氧化三甲胺和α化苯乙酰谷氨酰胺顯著增高。對慢性腎衰竭動物模型尿液的研究發現,模型尿液中富馬酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等的水平較對照組明顯增高[6-7]。

3.2 CKD 3～4期濕濁證患者尿液潛在生物標志物的關系 本研究結果提示CKD 3～4期濕濁證患者尿液潛在生物標志物包括熊果苷、肌酸、水楊苷、胍基乙酸和4氧代脯氨酸。既往研究證實熊果苷具有多種臨床作用,如止咳化痰,降低血糖,提高免疫力,抗菌、美白等功效,在臨床上廣為應用[8-10]。機體尿液中熊果苷表達過高,會導致患者出現倦怠乏力、少氣懶言、面色萎黃、眩暈等癥狀[11]。水楊苷在機體尿液中表達過高是由于機體糖酵解的異常,水楊苷是蜂膠的有效成分,具有抗炎降糖、解熱鎮痛、提高機體免疫力及抗氧化等功效[12-14]。機體尿液中水楊苷表達過高,臨床可表現為:低熱,肢體困重,口渴等癥狀[15]。胍基乙酸經研究證實具有多種生理作用,如調節神經系統、抗氧化,促進胰島素分泌、平衡精氨酸和脯氨酸代謝等[16-19]。機體尿液中表達量過高,可能出現頭重如裹,小便量增加,口干等癥狀。肌酸最早見于骨骼肌中。肌酸可以促進成骨細胞分化、抑制脂肪細胞的分化,提高肌肉細胞的分化[20-22]。此外,提高機體內肌酸的表達量,可以抑制氧化應激反應,恢復成肌細胞的分化能力,且在能量代謝中起到重要作用。機體尿液中表達量過高,可能出現肢體困重、倦怠乏力、體型肥胖、胸悶心悸等癥狀。4氧代脯氨酸具有促體內器官纖維化的作用,機體尿液中4氧代脯氨酸表達量的下降會導致機體出現小便量少、下肢浮腫、惡心嘔吐、胸悶心悸、皮膚瘙癢、面色萎黃等尿毒癥癥狀[23]。中醫濕濁證主要表現為倦怠乏力、口中黏膩、惡心嘔吐、食少納呆、肢體困重、頭重如裹、脘腹脹滿、小便渾濁、大便溏薄、舌苔厚膩等。

3.3 血清代謝組學在CKD中的應用 目前有關中醫藥干預CKD的代謝組學研究已經取得一些進展,例如,魯瑩等[24]應用代謝組學技術研究發現,昆仙膠囊可以降低狼瘡性腎炎小鼠24小時尿蛋白水平,抗雙鏈DNA抗體水平及抗ANA抗體,同時小鼠血清中檸檬酸、α-酮戊二酸、乳酸、谷氨酰胺、肌酐、葡萄糖、丙氨酸降低,馬尿酸鹽明顯升高。梁琦等[25]應用代謝組學技術研究發現,漢防己可造成腎功能的下降,但是通過配伍黃芪后,腎功能損傷有所下降。李春雨等[26]應用代謝組學技術研究發現,大黃可以通過降低慢性腎衰竭大鼠血液中的磷酸酯類物質分解、兒茶酚胺類物質的生成及炎癥介質的產生,從而具有治療慢性腎衰竭的作用。HUANG等[27]通過對CKD患者血清研究發現,淫羊藿具有調節脂質代謝、抗氧化、調節腸道菌群紊亂等作用。這些研究說明,代謝組學的研究方法具有整體性、系統性、動態性,能夠全面地揭示中醫藥在治療疾病過程中,生物體系內所發生的一系列變化,最終更好評價藥效和發現藥物作用機制。

3.4 CKD 3～4期濕濁證患者血清潛在生物標志物的關系 本研究結果提示CKD 3～4期濕濁證患者潛在生物標志物包括蘋果酸、富馬酸、α果酮戊二酸、檸檬酸、丙酮酸及琥珀酸半醛。既往研究證實蘋果酸是三羧酸循環的中間體,體內水平增多可導致機體出現多種代謝途徑的紊亂,例如脂質代謝紊亂,能量代謝紊亂,故表現為倦怠乏力、四肢困重[28]。富馬酸在體內水平表達過高可導致患者能量代謝紊亂,出現食少納呆,口中黏膩[29]。既往研究證實α2酮戊二酸為腎小管損傷的標志物,其濃度在體內表達的增加,導致腎小管濃縮功能障礙,繼而出現小便渾濁等臨床癥狀[30]。檸檬酸在體內的積蓄會導致機體腸道菌群的紊亂,繼而出現腹脹便秘,大便溏薄,惡心嘔吐等消化道癥狀[31]。琥珀酸半醛在體內表達的增多會導致4-羥基丁酸的升高,繼而影響人體的神經系統,導致多種神經遞質遭到破壞,繼而出現頭暈頭痛[32]。丙酮酸在機體能量代謝中也起到重要作用,是糖酵解的終產物,糖代謝障礙,導致機體能量的供給受阻,繼而出現一系列代謝異常,導致多方位的代謝紊亂。而這些代謝途徑的紊亂相互作用,相互影響,最終導致患者出現一系列相關癥狀,例如口干、乏力、小便渾濁、肢體肥胖等。而中醫濕濁證主要表現為惡心嘔吐、倦怠乏力、肢體困重、頭重如裹、食少納呆、脘腹脹滿、口中黏膩、小便渾濁、大便溏薄、舌苔厚膩等。

綜上所述,可將CKD 3～4期濕濁證患者尿液中熊果苷、肌酸、水楊苷、胍基乙酸和4氧代脯氨酸的表達量的變化作為診斷的潛在生物標志物;將CKD 3～4期濕濁證患者血清中蘋果酸、富馬酸、α果酮戊二酸、檸檬酸、丙酮酸及琥珀酸半醛的表達量的變化作為診斷的潛在生物標志物。

在今后的研究中可以通過擴大樣本量及去除年齡、原發病、性別、病理類型等干擾因素,以明確濕濁證與其他證候的差異,充分發揮血清及尿液代謝組學的整體性、預知性、前瞻性的優勢,對每種中醫證型的研究和中醫證型的本質探索具有深遠的應用前景。

利益沖突聲明:無。