補腎活血方治療特發性肺間質纖維化的網絡藥理學研究與實驗驗證

呂 鵬 李 芮 劉曉明

(1 山東中醫藥大學,濟南,250014; 2 山東中醫藥大學附屬醫院,濟南,250014)

特發性肺間質纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)是不明原因導致的肺間質病變致使肺功能迅速惡化,并最終發展為呼吸衰竭甚至死亡[1-2],其發病機制尚未完全明確,主要病理因素涉及肺上皮細胞損傷、上皮-間質轉化發生、成纖維細胞增殖、血管新生與重塑等多種過程[3-4]。關于IPF的治療,目前證明切實有效的治療方案不多。2022年由美國胸科學會(American Thoracic Society,ATS)、歐洲呼吸學會(European Respiratory Society,ERS)、日本呼吸學會(Japanese Respiratory Society,JRS)共同頒布的最新指南提出IPF的治療包括藥物如尼達尼布和吡非尼酮和非藥物如補充氧氣和(或)肺康復2種治療方案[5]。除吡非尼酮、尼達尼布有條件推薦使用外,此前治療方案中的大部分藥物因為療效不明顯且不良反應大,均被列為有條件不推薦使用或強烈不推薦使用范圍[5-6]。因此,發揮中醫藥的優勢,探索驗方補腎活血方延緩IPF進展的分子機制,對下一步開發新藥,解決世界性的纖維化治療難題具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細胞 10周齡健康新西蘭兔10只,體質量2.5～3 kg,購自濟南西嶺羊角養殖繁育中心,動物許可證號:SCXK(魯)20150001。山東中醫藥大學附屬醫院實驗動物倫理委員會審核通過了實驗流程(倫理審批號:AWE-2019-056)。飼養條件:室溫22～25 ℃、濕度40%～60%和12 h黑暗與光照交替的環境及正常飲食。在實驗開始前進行5 d的適應性喂養。人胚肺成纖維細胞MRC-5(南京凱基生物科技發展有限公司,貨號:KG508)培養于山東中醫藥大學附屬醫院細胞實驗室。使用含10%的胎牛血清的不完全杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle Medium,DMEM),放入5%CO2、37 ℃培養箱中培養MRC-5細胞,當培養瓶內細胞生長達80%左右時,用胰酶消化傳代,選擇第3～4代細胞用于實驗。

1.1.2 藥物 補腎活血方:人參9 g、熟地黃15 g、黃芪30 g、虎杖12 g、山茱萸9 g、丹參15 g、當歸15 g、川貝母6 g、五味子6 g、黃芩12 g、麥冬15 g、炙甘草6 g。購自山東中醫藥大學附屬醫院,產品質量符合《中華人民共和國藥典》(2020年版)標準。

1.1.3 試劑與儀器 MEM培養基(GIBCO,美國,貨號:11095080);胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(GIBCO,美國,貨號:10099141);轉化生長因子-β1(Transforming Growth Factor-β1,TGF-β1)(上海皓元生物醫藥科技有限公司,貨號:HY-P7118);二甲亞砜[阿拉丁試劑(上海)有限公司,貨號:B1328005];1640培養液(GIBCO,美國,貨號:1171219)。超凈工作臺(蘇州凈化,型號:SW-CJ-IFD);二氧化碳恒溫培養箱(SANYO,日本,型號:MCO-18AC);水平電泳儀(上海天能科技有限公司,型號:EPS-300);蛋白轉膜儀(上海天能科技有限公司,型號:VE-186);蛋白電泳儀(上海天能科技有限公司,型號:VE-180)。

1.2 方法

1.2.1 補腎活血方成分及其靶點的獲取 補腎活血方中共有12味中藥,分別是人參、黃芪、熟地黃、山茱萸、麥冬、五味子、當歸、丹參、黃芩、川貝母、虎杖、炙甘草,其所含化合物可視為補腎活血方的成分。本研究依據指南從草藥成分靶點數據庫(Herbal Ingredients′ Targets Database,HIT)(http://lifecenter.biosino.org/hit/)、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(https://tcmsp-e.com/)、網絡藥理學在線數據庫(Traditional Chinese Medicines Integrated Database,TCMID)(http://www.megabionet.org/tcmid)3個數據庫及文獻檢索中收集到645個化合物[7]。在此基礎上,運用化合物相互作用搜索工具(Search Tool for Interacting Chemicals,STITCH)數據庫(http://stitch.embl.de/)檢索上述化合物的靶點,最終檢索到524個化合物和2 904個靶點之間形成了126 549個互作關系。

1.2.2 IPF相關疾病基因獲取 基于先前的臨床觀察及實驗研究,發現補腎活血方對治療IPF效果顯著[8]。本研究從MalaCards人類疾病數據庫(The Human Disease Database)(https://www.malacards.org/)中獲得IPF的疾病標準ID:PLM134,并收集到IPF相關基因162個。

1.2.3 批準的IPF藥物標靶獲取 美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準的治療IPF的藥物有2種,分別是吡非尼酮和尼達尼布。本研究從DRUGBANK數據庫(https://drugbank.com/)中分別提取2種藥物的相關靶點。其中吡非尼酮相關靶點5個,尼達尼布相關靶點21個。

1.2.4 補腎活血方的活性成分篩選 補腎活血方是口服給藥,其發揮藥效受藥物“吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)和外排(Excretion)(ADME)特性的限制,ADME值低,往往意味著藥物不能在相應靶點發揮良好的藥效反應,而藥物ADME的性質常常可以通過類藥性指數(Quantitative Estimate of Drug-likeness,QED)反映[9]。該指標整合了8個被普遍認為對類藥性分析相對重要的分子描述符:1)分子質量;2)氫鍵供體(Hydrogen Bond Donor,HBD)的數量;3)辛醇-水分配系數(Octanol-Water Partition Coefficien,AlogP);4)氫鍵受體(Hydrogen Bond Acceptor,HBA)的數量;5)旋轉鍵(Rotatable Bond,ROTB)的數量;6)芳環(AROM)的數量;7)分子的極性表面積(Polar Surface Area,PSA);8)結構警報的數量。一般認為,QED值越大類藥性越好,參考相關研究[10],將QED值設定為0.4以篩選出補腎活血方的活性成分。

1.2.5 補腎活血方的核心靶點篩選 首先運用基于網絡節點距離和路徑的重啟隨機游走算法(Random Walk with Restart,RWR)方法評價補腎活血方靶點與IPF疾病基因之間的相關性[11-12]。利用STITCH數據庫中的藥靶關聯性閾值對獲取的2 904個靶點進行篩選[13],該閾值設定為>400[14]。基于以上結果,按照二項分布理論計算靶點與k個以上活性成分具有相互作用的概率P(X≥k)[15],P越小篩到的靶點越重要,設P<0.001。最后,將獲取的上述靶點與IPF相關基因結果分別去重后取交集,得到補腎活血方的核心靶點。

1.2.6 蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建 在String數據庫(https://www.string-db.org/)中輸入核心靶點,得到靶點之間的相互作用關系,同時導出PNG格式和TSV格式。將TSV格式中Node1和Node2數據導入Cytoscape 3.8.1軟件,構建蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡。將活性成分-靶點.xlsx文件和中藥-活性成分-靶點.xlsx文件分別導入Cytoscape 3.8.1軟件,構建網絡,預測出補腎活血方治療IPF的活性成分-靶點和中藥-活性成分-靶點的網絡關系圖,利用Network Analyzer插件進行網絡拓撲屬性分析,在該網絡中,圓的大小(Size)、透明度(Transparency)及標簽字號(Label Font Size)均根據Degree值定義。Degree值越高表明該靶點的作用越關鍵,與該節點的連線越多。邊的粗細(Width)、透明度(Transparency)均根據Combined Score值定義。Combined Score值越高,表明2個靶點之間的相互作用越強,該節點起到的作用越為關鍵。其中,綠色圓形圖標代表的是核心靶點,黃色菱形圖標分別代表12味中藥,方形圖標代表中藥的活性成分,其中圍繞中藥的方形圖標是其獨特的活性成分,藍色方形圖標代表的是某幾種中藥共有的活性成分。中藥以各自首字母縮寫為標簽,如“黃芪”的標簽是“HQ”,因“黃芪”與“黃芩”首字母縮寫相同,故定義黃芩的標簽為“HQIN”。為標準化活性成分名稱,更清晰地用網絡圖表現互作關系,本研究中的所用活性成分均轉化為PubChem CID號。

1.2.7 補腎活血方治療IPF核心靶點的基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析 運用基因列表注釋和分析網站(Metascape)數據庫(https://metascape.org/),導入補腎活血方治療IPF的50個核心靶點,GO富集分析和KEGG富集分析,限定物種為“homo sapiens”,篩選P<0.05的條目,最終富集結果包括:生物過程(Bioligical Process,BP)、細胞組分(Cellular Component,CC)、分子功能(Mokecular Function,MF)相關過程。對富集排名靠前的20個條目作圖,并把核心靶點投射到KEGG通路圖中以預測補腎活血方治療IPF的分子機制。

1.2.8 分子對接分析 分子對接主要用于蛋白質和小分子的結構對接,并評估小分子與蛋白質結合位點的親和力。若對接的Affinity值為負值,則提示小分子和蛋白質的結合是自主有效的[16]。本研究在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)中對排名前10的靶基因胱天蛋白酶3(Caspase 3,CASP3)、腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)、Jun激酶(Jun Kinase,JNK)、腫瘤蛋白p53(Tumor Protein P53,TP53)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶3(Mitogen-Activated Protein Kinase 3,MAPK3)、C-X-C基序趨化因子配體8(C-X-C Motif Chemokine Ligand 8,CXCL8)、基質金屬蛋白酶9(Matrix Metalloproteinase 9,MMP9)、白細胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、細胞間黏附分子(Intercellular Adhesion Molecule,ICAM)與補腎活血方中GED值排名靠前的活性成分進行分子對接驗證。首先,查找合適的蛋白構象并準備PDB文件,查找的基本原則[17]如下:1)來源于人(Homo Sapiens)的蛋白結構;2)構象分辨率一般在2.5 ?以內,盡可能清晰;3)蛋白質構象序列要盡量完整,結構復合體中必須要有小分子配體信息;4)結晶pH值應盡量接近人體正常生理范圍;然后,運用TCMSP數據庫準備相應活性成分的結構圖,以mol2格式保存;最后將二者導入采用AutoDock Vina軟件,加氫,去水,進行分子對接。根據對接結果,選擇Affinity為負值且均方根差(Root Mean Square Deviation,RMSD)分值<2[18]的利用PyMol 2.5.2軟件進行可視化分析。

1.2.9 補腎活血方與批準藥物共同靶點的KEGG富集分析與分子對接 本研究對共同靶點進行了KEGG富集分析,并通過PubMed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)對IPF的分子機制進行文獻檢索,將共同靶點中的血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、血小板衍生生長因子(Platele Derived Growth Factor,PDGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)的受體以及Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、細胞色素P450家族3亞家族A成員4(Cytochrome P450 Family 3 Subfamily A Member 4，CYP3A4)確定為本研究的關鍵靶點，將關鍵靶點與補腎活血方中對應的QED值和藥靶相關性較高的活性化合物進行分子對接。同時將吡非尼酮、尼達尼布與各自對應的關鍵靶點進行分子對接，對每次對接進行打分。

1.2.10 含藥(補腎活血方)血清制備 補腎活血方中藥湯藥制備:根據人的用藥量,結合人和動物體表面積折算的等效劑量比值表分別計算。將8倍新西蘭兔等效劑量的中藥準確稱取,加入8倍量的水浸泡后煎煮,水沸后小火煎煮約30 min后濾出藥液;然后,再次加入6倍量的水繼續煎煮20 min濾出藥液。將2次藥液合并后過濾濃縮,濃度為3 g/mL,置4 ℃冰箱保存備用。

制備過程:健康新西蘭兔按照隨機數字表法分為含藥血清組和正常血清組。給予8倍新西蘭兔等效劑量的中藥灌胃,給藥量為56 g/kg(生藥量),灌胃前禁食不禁水12 h,1次/d,連續給藥7 d后,第7天灌胃1次,給足1 d劑量。末次給藥后1 h在家兔自然清醒狀態下,以1%利多卡因5 mL腹腔內注射麻后從腹主動脈采血。血液于37 ℃下靜置1 h,待凝血后以5 000 r/min,離心半徑8 cm,離心10 min,常規分離血清,并將同組家兔的血清合并,56 ℃水浴30 min滅活補體,用0.22 μm醋酸纖維素膜過濾除菌,-20 ℃保存備用。正常血清組:以生理鹽水灌胃,相同方法采血制備血清。

1.2.11 MTT法篩選含藥(補腎活血方)血清的最佳血藥濃度 將細胞隨機分為正常組(正常DMEM培養基)及不同稀釋濃度(1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128)含藥血清干預組等9組,每組8個復孔。置于37 ℃ 5%CO2培養箱中,于培養24 h后,吸棄培養液,培養板每孔加入20 μL 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽液(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT),培養箱中孵育4 h后,吸取MTT液,加入DMSO,振蕩搖勻后在避光孵育15 min,選擇波長490 nm處,酶標儀讀取各孔OD值并記錄。統計每組OD值,每組實驗重復操作3次。

1.2.12 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖及增殖抑制率的影響 增殖抑制率(%)=(1-觀察組OD值/對照組OD值)×100%。將人胚肺成纖維細胞以1×105/孔接種于96孔板,培養24 h,空白對照組,TGF-β1處理組,TGF-β1處理+最佳濃度含藥血清干預1 h組(含藥血清組)分別加入不同溶液,空白對照組加入等量PBS溶液,作用24 h,吸去上清,除空白對照組外,每孔加入TGF-β1繼續培養48 h。然后將對應孔更換100 μL新的培養基,分別加入10%的CCK-8,放入培養箱中繼續培養,4 h后取出,放入酶標儀中,450 nm測OD值。

1.2.13 蛋白質印跡法(Western Blotting)檢測1型膠原(Type I Collagen,COL-Ⅰ)、IL-17A、輕鏈3Ⅱ(Light Chain 3Ⅱ,LC3Ⅱ)(膜型自噬體)含量的變化 抽提總蛋白,具體操作按試劑盒說明進行。最后放入凝膠成像儀中顯影。

2 結果

2.1 補腎活血方活性成分及核心靶點 在獲取的524個化合物經過如前所述的篩選之后,最終有201個的補腎活血方的化合物和對應的470個靶點被保留下來用于后續的分析。上述470個靶點與IPF疾病基因取交集,此時得到的靶點即為本研究中補腎活血方的50個交集靶點。見圖1。50個交集靶點分別是TGFB1、CCL2、CXCL8、CXCL5、IL-13、IL-1B、CXCR3、IFNG、EDN1、CXCL9、MMP9、CXCL12、TIMP1、CCR4、MMP1、CXCR2、CXCL10、CCR6、VCAM1、CXCR1、CXCL1、FN1、CCR7、TNF、AGT、COL1A1、IL-6、LPAR1、VEGFA、SERPINE1、ALOX5、CTNNB1、AKT1、IL-10、ACTB、ALB、CXCR4、CCR2、AGTR2、STAT3、TP53、TLR4、JNK、HIF1A、MMP2、MPO、MAPK3、ICAM1、PPARG、CASP3。另外,交集靶點所對應的補腎活血方活性成分共118個。

圖1 補腎活血方與IPF交集靶點示意圖

2.2 基于網絡的靶點相關性分析 分別計算Original Average Score和Random Average Score,這個過程被獨立重復了500次,P<0.01。見表1。

表1 基于網絡的靶點相關性分析結果

2.3 補腎活血方治療IPF的核心靶點網絡圖 Degree值較高的核心靶點有CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9和CXCL8等。見圖2。

圖2 核心靶點網絡

2.4 補腎活血方治療IPF的活性成分-核心靶點網絡 通過前述篩選,共有118種補腎活血方的活性成分對應50個核心靶點。見圖3。活性成分-核心靶點網絡中,有168個節點,801條作用關系。拓撲分析結果顯示,白藜蘆醇(CID445154)具有最多的潛在靶點,有62個;其次是槲皮素(CID5280343)和腺苷(CID60961),分別含有35個潛在靶點和32個潛在靶點。從蛋白靶點的角度分析,Degree值較高的靶點有:CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG等。其中CASP3和TNF分別與58個化合物、43個化合物存在相互作用。

圖3 活性成分-核心靶點網絡

2.5 補腎活血方治療IPF的中藥-活性成分-核心靶點網絡 中藥-活性成分-核心靶點網絡中包含198個節點,1 325條作用關系。見圖4。為了更好地表征中藥、活性成分與核心靶點的關系,分別在表2和表3中展示出了共有活性成分在補腎活血方中的分布以及活性成分和核心靶點在補腎活血方中的分布。其中,補腎活血方中的共有活性成分共有39種,以補腎藥山茱萸中分布的各種活性成分和核心靶點最多,其次為益氣活血藥,如黃芪、人參、當歸、丹參、虎杖等,再次是斂陰潤肺止咳藥,如人參、麥冬、川貝、五味子等。諸藥配伍,加強共有活性成分及核心靶點發揮作用。

表2 共有活性成分在補腎活血方中的分布

表3 活性成分和核心靶點在補腎活血方中的分布(個)

圖4 中藥-活性成分-核心靶點網絡

2.6 核心靶點GO分析和KEGG分析結果 GO分析結果顯示共有1 464個BP,27個CC和60個MF相關過程。其中涉及BP富集排名靠前的有:運動的正向調節、白細胞遷移、細胞成分的正向調節、轉移、細胞運動的正向調節、細胞遷移的正向調節、細胞因子介導的信號轉導通路、血管發育、趨化性、反射運動等。涉及CC富集排名靠前的有:薄膜側面、質膜外側、細胞外基質、外封裝結構、含膠原蛋白的細胞外基質、分泌顆粒管腔、胞質小泡腔、水泡腔、內質網腔、血小板α顆粒管腔區等。涉及MF富集排名靠前的有:信號受體調節活性、細胞因子受體結合、受體配體活動、信號受體激活物的活性、細胞因子活性、G蛋白耦聯受體結合、趨化因子受體結合、G蛋白耦聯肽受體活性、肽受體活性、生長因子活性等。見圖5。KEGG分析結果顯示P<0.05的富集排名前20位的條目進行可視化展示,包括:細胞因子-細胞因子受體相互作用、糖尿病患者年齡-RAGE信號通路的研究并發癥、癌癥中的通路、趨化因子信號通路、蛋白多糖與癌癥、IL-17信號通路、類風濕性關節炎、腫瘤壞死因子信號通路、流體切應力與動脈粥樣硬化、甲型流感等。見圖6。

圖5 核心靶點GO分析(TOP10)

圖6 核心靶點的KEGG分析

2.7 補腎活血方活性成分與核心靶點分子對接 結果顯示與CASP3蛋白構象穩定的小分子有:黃芩黃酮1,結合能為-6.6 kcal/mol(1 kcal/mol=4.184 kJ/mol),RMSD=1.4 ?。與TNF蛋白構象穩定的小分子有:漢黃芩素,結合能為-9.4 kcal/mol,RMSD=0.7 ?。與JNK蛋白構象穩定的小分子有:千層紙素,結合能為-9.3 kcal/mol,RMSD=0.8 ?。與TP53蛋白構象穩定的小分子有:漢黃芩素,結合能為-7.5 kcal/mol,RMSD=1.1?。與AKT1蛋白構象穩定的小分子有:漢黃芩素,結合能為-9.3 kcal/mol,RMSD=0.9 ?。與MAPK3蛋白構象穩定的小分子有:二氫木蝴蝶素A,結合能為-8.3 kcal/mol,RMSD=0.8 ?。與IL-6蛋白構象穩定的小分子有:千層紙素,結合能為-5.9 kcal/mol,RMSD=0.5 ?。與MMP9蛋白構象穩定的小分子有:漢黃芩素,結合能為-9 kcal/mol,RMSD=1.1 ?。與ICAM1蛋白構象穩定的小分子有:大豆苷元,結合能為-8.4 kcal/mol,RMSD=0.5 ?。以結合能對構象的穩定性進行排序,得到前3位的對接模式。見圖7。

圖7 補腎活血方活性成分與核心靶點分子對接模式注:A.漢黃芩素-TNF(PDBID:5wjj);B.千層紙素-JNK(PDBID:4EBV);C.漢黃芩素-AKT1(PDBID:4ENJ)

2.8 基于KEGG富集分析與分子對接比較補腎活血方與批準藥物 尼達尼布和吡非尼酮的相關靶點與補腎活血方相關靶點交集包括血管內皮生長因子受體1(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 1,VEGFR1)、血小板衍生生長因子受體(Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha,PDGFRA)、成纖維細胞生長因子Ⅱ型受體(Fibroblast Growth Factor Receptor 2,FGFR2)、Lyn原癌基因(LYN Proto-Oncogene,LYN)、CYP3A4等。見表4。KEGG通路分類主要涉及新陳代謝、環境信息處理等方面。見圖8。其中Ras信號通路和PI3K-AKT信號通路富集最顯著。其中,與VEGFR2蛋白構象穩定的小分子有:白藜蘆醇,結合能為-9.1 kcal/mol,RMSD=1.1 ?;與FGFR2、LYN蛋白構象穩定的小分子有:環巴胺,結合能分別為-10 kcal/mol、-8.9 kcal/mol,RMSD=0.3 ?。見表5～6,圖9。

表4 補腎活血方與批準藥物之間的共同靶點

表5 補腎活血方與批準藥物的關鍵靶點分子對接參數

表6 補腎活血方及批準藥物的活性成分與關鍵靶點的分子對接結果

圖8 補腎活血方與批準藥物共同靶點的KEGG富集分類

圖9 補腎活血方活性成分與批準藥物的關鍵靶點分子對接模式注:A.白藜蘆醇-VEGFR2(PDB ID:3VHE);B.環巴胺-FGFR2(PDB ID:3RI1);C.環巴胺-LYN(PDB ID:6FMN)

2.9 MTT法篩選含藥(補腎活血方)血清的最佳血藥濃度 與對照組比較,隨含藥血清作用濃度的升高,對人胚肺成纖維細胞均有明顯的抑制作用,抑制程度逐漸增強,呈劑量依賴性,當含藥血清的藥物濃度達0.062 5倍(1/16)時,使細胞抑制率達到10.06%,該藥物劑量下,細胞抑制率較低,對人胚肺成纖維細胞損傷小,藥物濃度相對安全,可以考慮將含藥血清濃度稀釋16倍后的濃度定為該實驗的最佳血藥濃度。見圖10。

圖10 不同濃度含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖的抑制情況

2.10 CCK-8(Cell Counting Kit-8)法檢測含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖及增殖抑制率的影響 與空白對照組比較,TGF-β1處理組的人胚肺成纖維細胞增殖水平顯著增加,差異有統計學意義(P<0.01),增殖率為15.2%。與TGF-β1處理組比較,含藥血清組細胞增殖水平降低,差異有統計學意義(P<0.01),并且用補腎活血方后的細胞增殖抑制率為22.7%。見表7。

表7 含藥血清對人胚肺成纖維細胞增殖及增殖抑制率的影響

2.11 各組人胚肺成纖維細胞中COL-Ⅰ、IL-17A、自噬小體LC3-Ⅱ蛋白含量情況 COL-Ⅰ:TGF-β1處理組細胞中COL-Ⅰ蛋白含量較空白組明顯增多,而含藥血清組細胞中COL-Ⅰ蛋白含量較TGF-β1處理組明顯降低。IL-17A:TGF-β1處理組細胞中IL-17A蛋白含量較空白對照組明顯增多,而含藥血清組細胞中IL-17A蛋白含量較TGF-β1處理組明顯減少。LC3-Ⅱ:與TGF-β1處理組比較,含藥血清組細胞中LC3-Ⅱ蛋白含量明顯增多。見圖11。

圖11 各組人胚肺成纖維細胞中COL-Ⅰ、IL-17、自噬小體LC3-Ⅱ蛋白含量情況

肺纖維化的發病機制尚未探明,現有的研究認為反復的肺泡上皮損傷觸發了纖維化的早期發展。這些損傷,再加上失調的傷口修復和成纖維細胞功能障礙,導致終末期肺纖維化中持續的組織重塑和纖維化[19]。

在IPF循證指南中,推薦有條件地使用尼達尼布和吡非尼酮來治療IPF[6]。隨著時間的推移,這些藥物已被證明可以降低IPF患者用力肺活量的下降速度[20-25]。其中,尼達尼布是一種三重酪氨酸激酶的細胞內抑制劑,包括抑制PDGF、FGF、VEGF等受體的激活[26]。吡非尼酮則被證明是一種細胞因子和生長因子調節劑,對多條通路具有抑制作用[27]。但是,這2種藥物雖然可以防止IPF的惡化,卻不能改善病情,其效果與患者的耐受性相關,現有的臨床研究發現惡心和皮疹是吡非尼酮治療中常見的不良反應,而腹瀉和肝功能異常在尼達尼布的治療中更常見[28]。而中藥在確定對抗纖維化有效的基礎上,可以通過個體化辨證、配伍或調整劑型等方法最大限度地減少不良反應,增強IPF患者對治療的依從性和耐受性,從而更好地改善病情。

在先前的臨床研究中已發現補腎活血方具有抗纖維化作用[29],但具體機制不明。本研究的實驗結果一方面表明了補腎活血方對治療IPF具有顯著特異性,另一方面發現CASP3、TNF、JNK、TP53、AKT1、MAPK3、IL-6、MMP9、CXCL8、PPARG靶點在補腎活血方治療IPF中發揮著重要作用。另外,漢黃芩素與核心靶點TNF、AKT1、MMP9、TP53均表現出良好的結合構象,可能是該方發揮作用的關鍵活性成分。不僅如此,為了借助已認證藥物尋找新藥,分子對接結果顯示,補腎活血方中的其他多種成分與已批準藥物的關鍵靶點PDGF、FGF、VEGF的受體以及LYN,也具有穩定的結合力,其親和力以及方均根偏差(Root-mean-square Deviation,RMSD評分與已批準藥物的類似,由此推測,補腎活血方的抗纖維化作用部分地通過阻斷PDGF受體、FGF受體、VEGF受體的激活來阻斷成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化,抑制上皮-間充質轉化,抑制炎癥和血管生成而實現,而白藜蘆醇、環巴胺最具此類功效。

從富集結果來看,補腎活血方大部分作用于感染和免疫類的通路,受影響較大的通路有細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine Recepetor Interaction)通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。將補腎活血方的核心靶點投射到這些富集的通路中,受影響最大的通路是細胞因子-細胞因子受體相互作用通路,它參與細胞天然和適應性的宿主炎癥防御、細胞生長、分化、細胞死亡、血管生成以及發育和修復過程,旨在恢復體內平衡[30]。但是,病理狀態下,重復的上皮損傷修復帶來的慢性炎癥可能導致了纖維化的發生[31]。補腎活血方中的活性成分調控了這一通路中的27個靶點,如趨化性細胞因子,涉及CXC、CC 2個亞族,包括關鍵的炎癥介質IL-1B、IL-6、TNF、IL-17,參與適應免疫的細胞因子:IL-13,以及TGF-β1[32]。在纖維化早期,補腎活血方中的活性成分可能通過這一通路,發揮抗炎作用,減少炎癥細胞和細胞因子的積累,在纖維化的后期,補腎活血方中的活性成分可能通過抑制TGF-β1,調節成FGF,從而抑制成纖維細胞增殖、肌成纖維細胞分化、膠原和纖維連接蛋白的合成以及細胞外基質的沉積。在治療IPF中這一通路主要是通過調節炎癥反應發揮的作用,有實驗證據表明,在小鼠中,通過抑制IL-8作用來阻斷中性粒細胞趨化可減緩博萊霉素誘導的肺纖維化的發展[33],這佐證了抑制炎癥通路在治療IPF中的重要性。然而在臨床試驗中,潑尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸三聯抗炎方案與安慰劑組比較差異無統計學意義,甚至增加了患者的住院及死亡風險[34-35]。關于這一矛盾,有研究者認為IPF患者的自然病史和臨床病程差異很大,尚不能確定炎癥在多大程度上是疾病的共同驅動因素,還是僅僅是一種附帶現象,但可以預測會有一部分患者受益于額外的或者低劑量的抗炎療法[32],或者說,在一定程度上,部分患者可能通過藥物的抗炎機制獲益。

除了調節炎癥反應,這條通路中還包含了IL-17信號通路、TNF信號通路中的基因,同時也是本研究富集到的2條關鍵通路,與免疫、腫瘤相關。TNF通過與IL-1β和IL-6協同誘導VEGF的產生,在血管生成中發揮作用[36]。另有研究表明IPF患者的肺泡灌洗液中的VEGF水平與蛋白通透性指數以及MMP3、7和9的水平正相關[37],而血清VEGF濃度則與IPF患者病情嚴重程度相關,可以作為預測預后的一種生物標志物[38],所以抑制TNF通路或者抑制VEGF受體的激活有望成為治療IPF的又一機制。通過分子對接發現,補腎活血方中的漢黃芩素(CID5281703)與TNF有穩定的結合構象,具有抗纖維化、抗癌作用[39-41],白藜蘆醇(CID445154)與VEGFR2也有著穩定的結合構象,能夠通過抑制TGF-β/Smad/ERK信號通路來預防博萊霉素誘導的肺纖維化[42],在體內外通過抑制氧化應激、炎癥反應、衰老、纖維化和腫瘤等對肺部疾病有良好的治療作用[43]。當然,除了補腎活血方中的活性成分在上述關鍵通路和核心靶點中發揮重要作用之外,傳統的“君、臣、佐、使”的配伍也使各個中藥發揮著更好的協同作用。此外,實驗部分發現補腎活血方可有效的降低人胚肺成纖維細胞內的膠原蛋白的含量,其作用途徑可能與阻斷IL-17A通路,激活細胞自噬有關,部分驗證網絡藥理學的預測。

綜上所述,通過中藥網絡藥理學、分子對接以及實驗驗證,為補腎活血方中的活性成分通過多靶點多通路治療IPF提供了客觀依據,體現了中藥復方多通路多靶點作用的特點,在后續工作應當進一步完善中醫證候與生物信息之間的關系,將補腎活血方中的分子對接良好的活性成分,如白藜蘆醇、漢黃芩素、環巴胺等進行深入的實驗研究驗證其抗纖維化的作用機制。

利益沖突聲明:無。