反向傳播人工神經網絡結合正交試驗優化荷葉降脂方的提取工藝

王迪磊 宋乃琪 楊凱麗 楊麒琳 郭子碩 肖五慶 楊天姿 李鵬躍 杜守穎

(北京中醫藥大學,北京,102488)

高脂血癥是一種常見的慢性疾病,且隨著人們生活水平的提高,高脂血癥的發病率呈現逐年增長的態勢。高脂血癥是指人體血液中的血脂含量超過正常的范圍,表現為血液中膽固醇、三酰甘油含量過高或者高密度脂蛋白的含量過低,現代醫學也稱為“血脂異常”[1]。高脂血癥是心血管疾病的一個重要誘因,與高血壓、冠心病等多種疾病聯系緊密[2-3],是現代醫學研究中的疑難雜癥,因此高脂血癥對癥藥物的開發也成為醫藥工作者的研究熱點。

荷葉降脂方由荷葉、菊花、枸杞子3味藥組成,具有降低血脂、保護血管的功效,在臨床上常以代茶飲或湯劑的方式供患者服用,用于治療高脂血癥、血管動脈粥樣硬化等疾病,療效明顯。方中君藥荷葉的主要成分為生物堿及黃酮類,現代研究表明荷葉中的生物堿類是其發揮降脂作用的主要活性成分[4-5],因此本研究選取荷葉堿作為含量測定的指標性成分進行后續試驗。

當前,應用于中藥最佳工藝或處方配比篩選的試驗設計方法較多,如正交設計、均勻設計、人工神經網絡優化法、星點設計、Box-Behnken設計等[6-7],不同方法各有優勢,但也存在相應的局限性。如正交設計適宜于水平數<5的多因素多水平試驗,均勻設計適宜于水平數較多的試驗,星點設計、Box-Behnken設計適宜于變量為連續變量且試驗次數較多的試驗,而人工神經網絡優化因其具有強大的非線性擬合能力尤其適宜于中藥復方的復雜體系研究[8-9]。因此,本研究以荷葉堿含量作為評價指標,采用正交試驗結合反向傳播(Back Propagation,BP)人工神經網絡優化法優選其最佳提取工藝參數,為該方后續醫療機構制劑的開發奠定研究基礎,同時為正交設計-BP人工神經網絡優化設計在中藥制藥領域的聯合應用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 賽多利斯電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,型號:BSA224S];電子天平(余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司,型號:JM-B10002);Thermo高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號:Ultimate 3000]。

1.2 試劑 三乙胺(批號:212510)、乙腈(批號:205309)、甲醇(批號:213476),均為色譜純,購自美國Fisher公司;娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司,批號:20210319)。

1.3 分析樣品 荷葉堿對照品(99.8%,中國食品藥品檢定研究院,批號:111566-201907);荷葉(北京仟草中藥飲片有限公司,批號:201208002);菊花(北京鶴延嶺藥業發展有限公司,批號:200815);枸杞子(北京鶴延嶺藥業發展有限公司,批號:201005)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Thermo Lot validation C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相為乙腈(A)-0.1%三乙胺溶液(B)梯度洗脫(0～40 min:A 20%～70%,B 80%～30%);檢測波長為270 nm;柱溫為30 ℃;進樣20 μL;流速1.0 mL/min。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取荷葉堿對照品適量,加甲醇溶解并混勻,制成荷葉堿質量濃度為11.35 μg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 干膏粉與提取溶劑比例考察 本研究擬不改變提取用溶劑,仍采用水作為溶劑進行提取,同時模擬工業生產多功能提取罐的提取過程,采用回流裝置進行提取。

稱取3倍量處方飲片,加水回流提取,水提液濃縮至稠膏狀態,60 ℃減壓干燥,得干浸膏,碎成浸膏粉,過四號篩。分別稱取干膏粉0.3 g、0.5 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超聲45 min,濾過,取續濾液進行測定。由SPSS 19.0統計軟件分析干膏粉與提取溶劑不同比例組的含測結果。統計結果顯示,2種比例所得的荷葉堿含量差異無統計學意義(P>0.05),選擇以25 mL甲醇提取0.3 g浸膏粉用于后續正交試驗中各組提取物的含量測定。

2.3.2 超聲提取時間的考察 稱取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,分別超聲30 min、45 min,濾過,取續濾液進行測定。由SPSS 19.0統計軟件分析超聲時間對指標性成分含量的影響,統計結果顯示,2種方法所得的荷葉堿含量差異無統計學意義(P>0.05),因此選擇超聲時間為30 min。

供試品溶液的制備方法最終確定:稱取干膏粉0.3 g置25 mL容量瓶中,甲醇定容,超聲30 min,濾過,取續濾液即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按照處方比例,制備不含荷葉的干膏粉,按照“2.3”項下供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

2.5 專屬性試驗 取“2.2”“2.3”“2.4”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量,按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示,色譜峰分離良好,陰性樣品在荷葉堿對照品相應色譜峰位置未檢出色譜峰。表明本方法系統適用性及專屬性均良好。見圖1。

圖1 荷葉堿高壓液相色譜法色譜圖(時間軸,單位min)注:A.對照品溶液;B.供試品溶液;C.陰性樣品溶液;峰1荷葉堿

2.6 線性關系考察 取對照品母液,加入甲醇依次稀釋為不同濃度,分別進樣測定峰面積。以峰面積(Y)對進樣濃度(X)進行線性回歸,得荷葉堿的回歸方程為Y=1.196 4X-0.052 1,r2=0.999 5。結果表明,荷葉堿在1.135～45.400 μg/mL濃度范圍內與峰面積線性關系良好。見圖2。

圖2 荷葉堿峰面積和進樣濃度線性關系

2.7 中間精密度試驗 取“2.2”項下對照溶液,按照“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次,測定荷葉堿的峰面積,計算相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)值。結果荷葉堿的RSD值為0.55%,此條件下儀器精密度良好(RSD<3%)。

2.8 供試品溶液穩定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣,測定荷葉堿的峰面積,計算RSD值。結果測得荷葉堿峰面積的RSD=0.84%,供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好(RSD<3%)。

2.9 重復性試驗 取干膏粉6份,每份約0.3 g,精密稱定,按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備供試品,進樣體積為20 μL,測定荷葉堿的峰面積,計算RSD值。結果測得荷葉堿含量為0.828 3 mg/g,RSD為1.68%,重復性符合實驗要求(RSD<3%)。

2.10 回收率試驗 取含荷葉堿為0.828 3 mg/g的同一批樣品6份,約0.15 g/份,精密稱定,精密加入荷葉堿濃度為0.113 5 mg/mL的對照品溶液1 mL,按照“2.3”項下供試品溶液的制備方法制備,進樣體積為20 μL,測定荷葉堿的峰面積,計算回收率,并計算RSD值。結果荷葉堿的加樣回收率為99.90%～103.96%,RSD值為1.48%,符合實驗要求(RSD<3%)。見表1。

表1 荷葉堿加樣回收率

2.11 樣品測定結果

2.11.1 吸水量考察 按照3倍處方量稱取飲片置圓底燒瓶中,加入12倍量水(按飲片重量計)每隔30 min用300目尼龍紗布濾過,測定濾液體積,至體積不再減少為止,計算飲片的吸水倍量,結果顯示飲片的平均吸水率為265%,約為飲片總重量的3倍。

2.11.2 正交提取工藝設計 參考臨床使用方法,飲片用水提取,以水提物中荷葉堿含量作為考察指標,加水倍量、提取時間、提取次數為因素,每個因素設計3個水平。見表2。

表2 水提正交試驗因素水平

2.11.3 含量測定 分別稱取3倍處方量的飲片,按照正交試驗因素水平表中各因素水平設計正交試驗,按照“2.3”項下方法制備供試品溶液,按照“2.1”項下色譜條件測定荷葉堿含量。見表3。采用SPSS 19.0統計軟件對正交結果進行方差分析。見表4。

表3 正交試驗結果

表4 正交試驗方差分析

由方差分析表可知,A因素(加水倍量)、C因素(提取次數)對荷葉堿轉移率有極顯著性影響,為主要因素;B因素(提取時間)沒有顯著性影響,各影響因素大小為C>A>B。由正交試驗結果表可知:A因素、C因素各水平間差異較大,選擇荷葉堿含量較高的A3、C3水平,B因素各水平間差異不大,結合實際考慮選擇提取時間較短的B1。綜上正交優選最佳工藝確定為A3B1C3,即12倍量水,提取3次,每次0.5 h。

2.11.4 基于正交試驗的人工神經網絡優化 以正交試驗中加水量、提取時間、提取次數3個因素數值作為輸入層,以荷葉堿含量作為輸出層,運用SPSS 19.0統計軟件編程建立BP人工神經網絡。設置隱含層為1個,選擇雙曲正切傳遞函數(tansig)作為隱含層傳遞函數,線性傳遞函數(purelin)作為輸出層傳遞函數對結果進行仿真輸出,對三因素各組合進行綜合評分。見表5,圖3～4。

表5 BP人工神經網絡函數訓練結果

圖3 綜合評分結果預測

圖4 因素重要性結果預測

由綜合評分結果預測圖可知,訓練曲線相關性良好,表明訓練結果準確可信。而因素重要性結果預測圖表明人工神經網絡預測各因素重要性為提取次數>加水倍量>提取時間,與正交方差分析結果一致。最終計算綜合評分得到BP人工神經網絡模型仿真優化最佳提取工藝:12倍量水,提取3次,1 h/次(A3B2C3)。見表5。

2.11.5 驗證試驗 稱取3倍處方量飲片,按正交試驗與BP人工神經網絡所優選的最佳提取工藝參數,分別平行安排3組試驗,測定出膏率及荷葉堿的含量,確定最佳提取工藝。見表6。

表6 驗證試驗結果

由試驗結果可知2種工藝的荷葉堿含量大致相同,工藝A3B2C3(12倍量水,提取3次,1 h/次)與工藝A3B1C3(12倍量水,提取3次,30 min/次)比較出膏率增加約2%,結合生產實際,在2種工藝指標性成分含量及出膏率差別不大的基礎上,建議選擇時間短,耗能低的A3B1C3作為最終提取工藝。

3 討論

人工神經網絡是在對人腦組織結構和運行機制的認識基礎上,模擬其結構和智能行為的一種工程系統,其適合研究非線性系統的特性為解決復雜問題提供了一種相對有效且簡單的方法[10-11]。

荷葉、菊花、枸杞子作為常見的藥食兩用中藥[12],在醫療與食品領域應用廣泛。而高脂血癥作為一種常見的慢性疾病,因此在治療上藥食同源類藥物就具有其獨特的優勢。現代研究表明,荷葉、菊花、枸杞子均具有良好的降脂作用,荷葉總生物堿可顯著降低血清中總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇含量,升高高密度脂蛋白膽固醇含量,調節脂質代謝紊亂;菊花總黃酮能提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性,增加細胞的抗氧化能力;而枸杞多糖在降脂的基礎上還具有防止動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的作用[13],因此也越來越多地被應用于高脂血癥的臨床治療及食療領域。

本研究以荷葉的主要降脂活性成分荷葉堿作為指標性成分[14],依據2020版《中華人民共和國藥典》選取甲醇作為溶劑對其進行溶解[15],并對溶劑體積比和超聲時間進行了考察,選取了最優的研究方法,重復性結果良好,表明方法穩定可行。

提取工藝的優化歷來都對制藥生產起著舉足輕重的作用,是新藥研發過程中的關鍵一步。而中藥復方由于其成分眾多,提取過程往往又會使多組分之間發生交叉化學反應,這也造成了中藥復方提取過程的模型多是非線性的且機制較為復雜,因此會對很多分析方法的結果造成影響。而BP人工神經網絡的一個顯著特性是通用近似性,又稱為萬能表達定理,即有1個隱藏層的多層感知機可以精確表示任意連續有界函數或布爾函數,有2個隱藏層的多層感知機可以精確表示任意函數。因此,神經網絡的非線性表達能力非常強,可以很好的近似數據中蘊含的非線性特征。另外神經網絡具有互連性和結構可塑性的信息處理單元,因此不要求分析變量滿足正態性及獨立性等條件,且具有自組織、自學習、聯想記憶等優良特性,對復雜體系的數據具有良好的適應能力,因此非常符合中藥復方作用體系的規律性探究[16-17]。

正交試驗雖然在優化工藝方面應用廣泛,但受限于因素水平的設定,正交試驗篩選出的最佳參數只能是已設水平的組合,因此可能只是較優組合而非最佳組合。本研究在各因素下分別設置了3個水平,適合于用正交試驗對其進行分析概括,因其是復方同時又選取了BP人工神經網絡優化的方式與正交試驗進行互補,共同參考2種分析方法的結果,如此不需要在正交的基礎上增加試驗次數即可獲得理想的試驗參數組合,結果更加準確可靠,可操作性較強[18-19]。最終本研究的正交試驗與人工神經網絡在加水量及提取次數方面得出的結論一致,后續試驗又對提取時間進行了考察驗證,篩選出了最佳的提取工藝參數,可為后續的制劑開發奠定一定的研究基礎[20]。

在中藥新藥或醫療機構制劑的研發過程中,長期以來在“唯成分論”的影響下,常采用有機溶劑替代水對有效成分進行提取、富集。這種提取溶劑的改變雖然能夠富集有效成分,但由于中藥成分的多樣性、復雜性,這種改變也可能引起毒性成分的富集,從而帶來安全性的風險,對痔血膠囊、仙牛健骨顆粒的研究均反映了這種風險[20-21]。因此,在對于來源于臨床經驗方的中藥復方制劑的開發時要充分考慮人用經驗,參照臨床用藥的工藝來進行制劑工藝研究具有更好的保障。荷葉降脂方來源于臨床經驗方,在臨床上多以代茶飲或湯劑的方式應用,為了尊重臨床用藥經驗,保障臨床療效,故在研究中提取溶劑仍以水為溶劑。

利益沖突聲明:無。