國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗藥性研究

高 琪，劉 梅，譚海蕓，王 琦，李興紅，張 瑋

（1北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點實驗室/北京市農林科學院植物保護研究所，北京 100097；2中國農業大學植物保護學院，北京 100193）

0 引言

葡萄白粉病由葡萄鉤絲殼菌(Erysiphe necator)引起，廣泛分布于世界主要栽培區[1]，在國內各葡萄產區均有發生[2]。葡萄白粉病主要為害葉片、幼果等幼嫩器官組織，一般造成減產15%～30%，嚴重時達70%～80%，在適宜發病的條件下產量損失可達100%[3]，嚴重威脅著葡萄的產量和質量，是葡萄生產上最具破壞性的病害之一[4]。已有研究報道了一些葡萄白粉病的抗病基因，但主要集中在野生葡萄中，到目前為止，生產中尚無高抗白粉病商品化葡萄品種的應用[5]。國內實際生產中的主栽葡萄品種以歐亞種為主，對白粉病普遍較敏感[6-8]，因此，化學防治仍然是當前國內葡萄白粉病防治的主要措施。

甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑(sterol C14-demethylase inhibitors，DMIs)因具有田間藥效穩定、持效期長、對白粉病的控制效果好等特點，近年來一直是國內葡萄白粉病防控的首選藥劑類型[9]。DMIs 類殺菌劑通過雜環上的氮原子與甾醇上的14α-脫甲基酶的血紅素-鐵活性中心形成配位鍵[10-11]，抑制由14α-脫甲基酶催化的脫甲基反應[12]，從而破壞麥角甾醇的合成，造成細胞膜的功能異常和結構損壞，使細胞非正常死亡[13]，該類藥劑由于作用位點專一和較強的靶標特異性，在田間實際生產中易導致病原菌產生抗藥性[14-16]。戊唑醇是國內防治葡萄白粉病使用較多的一種DMIs類殺菌劑，由德國拜耳公司于1986 年研發，2008 年在中國登記用于防治葡萄白粉病。2005年Colcol等[17]最早在美國弗吉尼亞州檢測到了葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗性。國內已有葡萄白腐病菌[18]、葡萄炭疽病菌[19]等病原菌對戊唑醇產生抗性的報道，尚無葡萄白粉病菌對戊唑醇敏感性的研究。近年來，國內葡萄生產中偶發藥劑防控失敗的現象，但迄今未見關于葡萄白粉病菌抗藥性的報道。檢測國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性，對于指導葡萄白粉病的科學用藥具有重要意義。

實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)作為一種核酸定量技術，具有快速、高靈敏性、高特異性、高精準度等優點，已被應用于多種病原微生物對殺菌劑抗藥性的檢測和定量分析[20-21]。此外，由于qPCR 不依賴于微生物的培養，對于專性寄生菌的檢測、監測等相關研究具有重要意義。qPCR 方法已用于葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)[22]、小麥白粉病菌(Blumeria graminis)[23]等對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑抗性等位基因的定量分析。研究表明，戊唑醇抗性菌株的產生主要是由于病原菌內CYP51基因序列的第495 位堿基由A 突變成T(A495T)，使得翻譯過程中139 位的酪氨酸(Tyr) 被苯丙氨酸(Phe) 取代(Y139F)[24-25]。近年來，已經基于A495T 開發出了葡萄白粉病菌(E.necator)[21]、小麥白粉病菌(B.graminis)[26]對DMIs 類殺菌劑抗藥性的快速定量分析方法。Pintye 等[21]使用qPCR 技術對葡萄白粉病菌抗性位點進行檢測，表明A495T突變是導致白粉病菌對戊唑醇產生抗性的主要原因，且qPCR 技術可顯著提高檢測速率并降低成本，比直接測序靈敏度更高[27]。

本研究以葡萄白粉病菌為研究對象，利用qPCR技術檢測國內主要葡萄產區葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗藥性，同時采用孢子萌發法測定其對戊唑醇的敏感性，比較2種方法結果的相關性，探索國內葡萄白粉病菌對戊唑醇抗性動態檢測的最適方法，旨在為科學合理使用藥劑防控該病害提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株2020 年8—11 月，在國內不同葡萄產區的葡萄白粉病病樣上分離純化得到134株葡萄白粉病菌，其中北京87株、湖南岳陽6株、寧夏銀川3株、云南元謀3株、江蘇蘇州35株。

1.1.2 接種材料 接種材料來自北京市農林科學院溫室種植的盆栽葡萄植株，品種為‘夏黑’，選取自上而下第2～4片嫩葉。

1.1.3 藥劑及試劑（盒）97%戊唑醇原藥，上虞穎泰精細化工有限公司生產。稱量0.1000 g原藥溶于9.7 mL丙酮中，配制成濃度為1×104μg/mL的母液，4℃保存備用。真菌基因組DNA 提取試劑盒（D1090-02，OMEGA 公司）、QIAquick 膠回收試劑盒（28704，QIAGEN 公司）、pEASY?-T5 Zero Cloning Kit（北京全式金生物技術有限公司）、質粒提取試劑盒（AP-MN-P-250，康寧有限公司）、TB Green?Premix Ex TaqTM（TaKaRa公司）。試驗所用試劑均為國產分析純。

1.1.4 培養基及儀器 水瓊脂培養基，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1000 mL；血球計數板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；RXZ-380D 人工氣候箱，寧波江南儀器廠；Nanodrop 2000c核酸濃度測定儀，ABI 7500實時熒光定量PCR儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與葡萄白粉病菌的純化擴繁 每個地區至少選擇1 個采樣點，每個采樣點用五點取樣法采集病樣，選取具有新鮮霉層且病斑分散的病葉，每個采樣點采集2～3片葡萄白粉病葉，每個采樣點之間間隔50～100 m或選擇不同地塊。田間采集的每一片葡萄白粉病葉使用自封袋單獨包裝，在保溫箱中用冰袋保鮮帶回實驗室。葡萄白粉病菌的純化擴繁參考賈靜怡等[8]的方法，在整張葉片上進行。

1.2.2 葡萄白粉病菌對戊唑醇抗性的qPCR檢測 采用DNA提取試劑盒提取葡萄白粉病菌的DNA。使用核酸濃度測定儀對提取的葡萄白粉病菌基因組DNA 進行核酸濃度測定，剔除波峰雜亂、雜質多的不合格樣品。葡萄白粉病菌對戊唑醇抗性的qPCR 檢測參考Pintye等[21]的方法，略有改動。

戊唑醇抗藥性檢測qPCR 內參基因載體的構建。選擇對戊唑醇EC50值最高的5 個菌株，假設其中存在A495T 突變的菌株，使用 EnCYP89F(5'-ATGCATGGGTCCAAGAATT-3')和EnCYP1752R(5'-AACCCTAACACCTGCCATAAA-3')擴增葡萄白粉病菌CYP51基因片段，將其轉入pEASY?-T5 Zero 克隆載體，挑取陽性克隆送北京擎科生物公司測序，對測序結果進行序列比對分析，含A495T突變的質粒即為內參基因載體，-20℃保存備用。

qPCR檢測。將葡萄白粉病菌的DNA濃度稀釋至20～40 ng/μL，利用 L502(5'-CGCCGA AGAGATTTACACTA-3') 和 qEN136R Reverse(5'-TGAGTTTGGAATTTGGACAATCAA-3')檢測供試菌株中是否存在A495T 點突變。20 μL 反應體系：TB Green Premix Ex Taq 10 μL、Rox Reference Dye II 0.4 μL、10 μmol/L 正反向引物各0.4 μL、RNase Free ddH2O 6.8 μL、DNA 模板2 μL。反應條件：60℃反應前處理1 min；95℃預變性1 min；95℃變性45 s，60℃退火45 s，共40 個循環；60℃反應后處理1 min。反應結束后檢測內參基因質粒和每一供試菌株DNA的擴增曲線和解離曲線，記錄循環閾值（Ct值）。

1.2.3 葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性測定 采用水瓊脂平板孢子萌發法進行。將戊唑醇母液用無菌水稀釋成適宜的有效成分濃度梯度，混入水瓊脂培養基，分別制備成終濃度為0、1、10、25、50、100、200 μg/mL 的含藥平板。挑選新鮮、分生孢子狀態一致、單斑純化擴繁的葡萄白粉病葉片，抖動病葉使白粉病菌分生孢子均勻鋪在含藥水瓊脂平板上。每個濃度梯度重復3 皿，以加入相同體積無菌水的水瓊脂平板為對照。25℃人工氣候箱中培養24 h（對照孢子萌發率在90%以上時），調查各處理的分生孢子萌發情況，當芽管長度超過孢子短半徑的一半時視為萌發，每處理隨機觀察3個以上視野，調查孢子總數不少于200個，分別記錄萌發分生孢子數和調查分生孢子總數，計算孢子萌發率(R)、分生孢子相對萌發抑制率(I)，見式(1)、(2)。

1.2.4 數據分析 根據內參質粒基因與每一株葡萄白粉病菌DNA經過擴增得到的Ct值，計算出質粒均值，根據式(3)～(4)，計算△Ct、△△Ct，求出2-△△Ct。若結果大于1，則視為陽性發生突變，即抗性菌株；若結果小于1，視為陰性為突變，即敏感菌株[21,28]。采用Excel 軟件進行數據分析。以含藥平板中藥劑濃度對數數值為橫坐標，分生孢子萌發相對抑制率為縱坐標，進行回歸分析，求出戊唑醇的毒力回歸方程、相關系數和EC50值。根據各葡萄白粉病菌菌株對戊唑醇的EC50值，與qPCR方法的抗感結果進行相關性分析，見式(3)、(4)。

2 結果與分析

2.1 qPCR法檢測國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗性

使用孢子萌發法測定菌株對藥劑的EC50值，不同濃度戊唑醇含藥平板對孢子萌發抑制作用如圖1 所示。使用qPCR 分子檢測技術對國內北京、湖南、江蘇、云南和寧夏5 個葡萄種植地134 株經DNA 檢測合格的葡萄白粉病菌進行A495T 檢測，將檢測到A495T突變的菌株確定為抗性菌株，結果表明，134株供試的葡萄白粉病菌菌株中，抗性菌株為47 株，抗性頻率為35.07%，敏感菌株87 株，占比64.93%（表1）。所有省份都出現了對戊唑醇表現抗性的葡萄白粉病菌菌株，不同地區菌株的抗性差異較大。

表1 國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗性

圖1 不同濃度戊唑醇含藥平板葡萄白粉病菌分生孢子抑制萌發情況

2.2 孢子萌發法檢測國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性

使用孢子萌發法測定了國內北京、湖南、江蘇、云南和寧夏5個葡萄種植省份134株葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性，EC50值的范圍在0.085～280.917 μg/mL之間，最大值是最小值的3304 倍，整體平均EC50值為(24.208±28.039) μg/mL，標準差較大說明群體中病菌總體的敏感性差異較大。同一省份不同區縣菌株對戊唑醇的敏感性差異較大，其中寧夏自治區銀川市的菌株間敏感性差異最大，差異倍數達3304；其次分別為北京市房山區、江蘇省昆山市，差異倍數分別為22.9和15.5。

將134株菌株的EC50平均值24.208 μg/mL設為1，各地區菌株均值與其比較，北京市朝陽區、平谷區、通州區、房山區，湖南省，云南省，江蘇省張家港市菌株的敏感性低于全國供試菌株的平均水平；北京市密云區、江蘇省昆山市的菌株敏感性處于居中水平；寧夏自治區菌株的敏感性高于全國供試菌株的平均水平（表2）。

表2 國內葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性

2.3 葡萄白粉病菌對戊唑醇敏感性2種檢測方法的相關性

使用孢子萌發法生物學檢測，和通過對已有A495T突變菌株進行克隆連接載體進行的qPCR分子檢測，共判定了國內5個葡萄產區134株葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗藥性。在較高的戊唑醇EC50值下，發生A495T突變的菌株比例逐漸增加（圖2）。根據葡萄白粉病菌對戊唑醇EC50值的范圍及均值，劃分了均值≤1倍(0＜EC50≤24.2 μg/mL)、1＜均值≤5 倍(24.2＜EC50≤121 μg/mL)和＞5倍(EC50＞121 μg/mL)3個范圍。在均值≤1 倍的86 株病菌中，有6 株發生A495T 突變，占6.98%；1＜均值≤5 倍的47 株病菌中，有40 株發生A495T 突變，占85.11%；均值＞5 倍有1 株病菌發生了A495T突變。

圖2 不同EC50范圍A495T突變頻率

同時檢測了2 種方法結果的相關性，將抗性菌株賦值為1，敏感菌株賦值為0，使用SPSS中Spearman相關性分析檢測相關性，結果表明相關系數為0.798**，在0.01水平（雙側）上顯著相關。

3 結論與討論

戊唑醇是一種高效的DMIs 類殺菌劑，但頻繁使用會使病原菌產生抗藥性，甚至導致藥劑防效完全喪失。早在1986年，在加利福尼亞就報道了三唑酮對葡萄白粉病的藥效下降的現象[29]，其次是在紐約、歐洲、加拿大等其他地區出現相關報道[30-32]。近年來歐美國家已經減少DMIs 類殺菌劑的使用，但是抗藥性現象依然不容小覷。現階段已有大量數據表明其所屬的DMIs 類殺菌劑抗藥性的產生是發生A495T 突變，導致相應蛋白質發生Y136F 突變[25]。本研究采用的qPCR 方法即通過檢測葡萄白粉病菌中是否存在A495T突變來判定菌株是否對戊唑醇藥劑產生抗性。

明確不同地區菌株對戊唑醇的敏感性，可以用于指導不同地區科學使用戊唑醇防治葡萄白粉病。本研究中采用孢子萌發法和qPCR方法，分別檢測了國內5個葡萄種植省份134株葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性，表明國內葡萄白粉病菌已經出現了對戊唑醇敏感性降低的現象。孢子萌發法檢測結果顯示，戊唑醇對供試的134株葡萄白粉病菌菌株的EC50范圍為0.085～280.917 μg/mL，平均EC50為(24.208±28.039) μg/mL。不同省份（區縣）的菌株對戊唑醇EC50的最大值和最小值之比為1.29～3304倍。不同省份（區縣）葡萄白粉病結果存在差異。江蘇和寧夏2個采樣點葡萄白粉病菌對戊唑醇的抗性水平較高，與采樣葡萄園頻繁使用DMIs類藥劑對葡萄白粉病有關，建議當地葡萄生產中減少戊唑醇等DMIs 類藥劑的使用，選擇其他類型殺菌劑替代和輪換使用；對于云南、北京等抗藥性水平較低的地區，建議加強DMIs類殺菌劑的抗藥性監測，科學合理使用DMIs 類殺菌劑防治葡萄白粉病，以減緩葡萄白粉病菌對DMIs類藥劑抗性的產生。

qPCR檢測結果表明，在134株葡萄白粉病菌菌株中，抗性菌株為47 株，抗性頻率為35.07%。隨著戊唑醇EC50值的增加，具有A495T突變的菌株比例不斷增大，說明A495T突變是導致白粉病菌對戊唑醇產生抗性的主要原因，這與Delye等[25]和Pintye等[21]的研究結果一致。Rallos等[24]在研究中發現了無A495T突變，但對DMIs類殺菌劑表現中等至高抗性表型的葡萄白粉病菌菌株，推斷CYP51的過量表達可能也是引起葡萄白粉病菌對DMIs類殺菌劑抗性的原因之一。本研究中，在具有較高EC50值的菌株中，即EC50值為均值1～5倍的47 菌株中，有7 株在qPCR 檢測方法中未檢測到A495T突變，這也可能是CYP51的過量表達造成的。

此外，本研究結果顯示，孢子萌發法測定的葡萄白粉病菌對戊唑醇的敏感性結果與qPCR方法檢測獲得的抗性結果顯著相關，因此，上述2種方法均可用于葡萄白粉病菌對戊唑醇抗藥性的檢測，2 種方法結合應用的結果還可能在對戊唑醇表現抗性的菌株中發現新的抗性位點。而當需在短時間內快速完成大量病原菌的抗藥性檢測時，可單獨采用qPCR方法。