甘薯莖腐病田間癥狀識別與快速鏡檢診斷研究

張莉麗，王 麗，謝關林，余山紅

（1浙江省杭州市農業技術推廣中心，杭州 310021；2浙江大學生物技術研究所，杭州 310058；3浙江省臺州市農業科學研究院，浙江臺州 317000）

0 引言

中國是世界第一甘薯生產國，對影響產量和品質的病害備受關注。甘薯莖腐病是中國2010年新報道的一種重要細菌病害[1]，目前在福建、廣東、河北、江西、廣西、海南、河南、重慶、江蘇（區）有發現[2-3]，已成為中國危害最重的甘薯病害之一。杭州市農業技術推廣中心植保站于2015年5月首次在浙江省發現該病害并請浙江大學植物細菌實驗室作了病原鑒定，明確了甘薯莖腐病是由Dickeya dadantii引起(Syn.Erwinia chrysanthemi)，從此浙江省的甘薯莖腐病研究與防控拉開序幕。由于甘薯在浙江省的重要地位，甘薯莖腐病于2016年被浙江省列入植物檢疫性有害生物補充名單。

作為植物檢疫性有害生物，產地檢疫是必須的，而產地檢疫對病害的典型癥狀及快捷的田間病害診斷特別重要，然而，國內對病害鑒定及病原的檢測均是借助高檔儀器的分子檢測及專業人員[4-7]，但作為地、縣植保植檢站根本不具備這些條件。為此，自2015—2019年連續5 年筆者對田間病害的癥狀作了深入細致的觀察，并對病原作了進一步的研究。發現了一些國內外沒有被仔細描述的病害初期癥狀特征，同時提出了快捷的癥狀結合光學顯微鏡鏡檢法，為甘薯細菌性莖腐病的快速產地檢疫及適時防控找到一條可行的途徑。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

供鑒定用2株標準對照細菌菌株Dickeya dadantiiLMG 2534 和D.dadantiiLMG 2804(Syn.Erwinia chrysanthemi)由比利時根特大學國際菌種保藏中心Swings 教授提供；D.dadantiiCZ15001,D.dadantiiCZ15002由浙江大學植物細菌實驗室提供。

1.2 病害田間癥狀觀察與記錄

在杭州地區甘薯莖腐病發病高峰期的5月上中旬及9月上中旬，選擇歷年發病較重的田塊，記錄田間小氣候的溫濕度，每天定點觀察病害的發生發展情況，與國內外記錄的病害癥狀描述作比較，拍照留存。對國內外沒有記載的病害癥狀除拍照外，采樣帶回實驗室進一步鑒定，對典型的甘薯莖腐病癥狀樣本只作莖、葉及葉柄上的噴菌現象觀察。對國內外沒有癥狀記錄的樣本或不典型的樣本除噴菌現象觀察外，還作病原的分離鑒定。

1.3 甘薯組織的光學顯微鏡檢

取一塊干凈的載玻片，在中間滴1 滴無菌水。甘薯病葉樣本用滅菌刀片直接切取6 mm×2 mm組織；甘薯病葉柄直接切取6 mm段，中間切開；甘薯病莖直接橫切莖部1 mm厚，包含木質部和韌皮部；分別將所取組織放入水滴中。先將蓋玻片的一側觸到水滴，蓋上蓋玻片后輕輕按壓，如組織較厚實，可從蓋玻片邊緣酌量滴入少許水，使所觀察組織在蓋玻片下充分浸潤，用吸水紙吸干載玻片上多余的水。把做好的切片放在低倍顯微鏡下觀察，將切片上的感病組織置于光源投射的中心，燈光不宜過亮，移動到病組織邊緣，觀察噴菌現象，即云霧狀細菌菌體（細菌溢）。

1.4 煙草過敏反應及致病性測定

煙草過敏反應(HR)采取背面注射法將菌液接種于本氏煙葉片上，28℃培養，24 h后觀察結果。致病性測定采用針刺法將菌液接種于扦插成活的健康甘薯植株莖基部，套袋保濕，置30℃光照培養箱中，3 d后開始觀察發病情況。

1.5 脂肪酸(FAMEs)分析

將在NA 培養基上生長24 h 的2 株甘薯莖腐病致病代表菌CZ15001、CZ15002 及2 株標準對照菌株，轉接到含3%胰蛋白酶的TSBA培養基上繼續培養24 h，然后每菌挑取約40 mg 的菌體，經過皂化、甲基化、萃取、洗滌過程獲取脂肪酸樣品[8]。脂肪酸鑒定采取全自動微生物鑒定系統——美國Agilent 6890 型氣相色譜系統。鑒定結果通過專化的微生物鑒定系統軟件——美國MIDI 公司開發的基于細菌脂肪酸成分鑒定細 菌的MIS4.5(microbial identification system) 和LGS4.5(library generation software)獲得。

1.6 病原的16SrDNA序列測定

病原菌基因組的提取及16S rDNA 序列測定，根據細菌16S rDNA 基因的通用引物[6,9]：F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3/R5’ -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。對病原基因組進行PCR擴增。反應體系為50 μL，反應條件為94℃，4 min；94℃，0.5 min；62℃，0.5 min；72℃，1.5 min；30個循環；72℃，10 min。PCR產物在1.0%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測后，用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit回收純化，由華大基因公司測序。

2 結果與分析

2.1 甘薯莖腐病田間癥狀識別

甘薯莖腐病在甘薯播種到收獲的各個時期均可發生，主要侵害甘薯的根、莖和葉柄，嚴重時葉片亦被感染。杭州地區5月上中旬和9月上中旬是反季甘薯病害發生的最適時期，甘薯苗期或扦插成活后一個多月內，此時常遇30～32℃的發病適宜溫度及80%以上的高濕，薯苗莖部自下而上突現水漬狀暗褐至黑色軟腐（圖1A），發病莖部最前端及葉柄上可見暗褐色條狀或波狀水漬狀斑（圖1B），腐爛處有惡臭、無菌膿，最后全株迅速枯亡（圖1C）。病害癥狀從始發至全株死亡一般在1 星期左右。在適溫和高濕條件下，有時可見甘薯葉片和葉柄上的水漬狀病斑（圖2A），但在陽光下隨葉片水分的蒸騰作用而馬上消失，因整株的頸部腐爛發生幾乎與葉片上的水漬狀病斑同時發生（圖2B），緊接著葉片和葉柄上的水漬狀病斑干燥即轉成黑色干枯斑（圖2C），最后整株枯死。杭州地區一般在6月上旬后和9 月中下旬后田間溫度不穩定，有32℃以上的高溫和25℃以下的低溫，而且濕度常低于70%，此時病害發生緩慢，隨著甘薯藤蔓不斷延長，匍匐在地上的藤蔓節上長出大量的不定根，被甘薯莖腐病菌感染的藤蔓莖部出現深褐色病斑（圖3A），由于濕度不是很高，莖部沒有馬上腐爛，有的病莖可一直維持到收獲期，呈現深黑色，干燥時病莖常出現縱裂；發病較輕的結薯小或成須根（圖3B）。田間收獲前，甘薯塊根受感染常出現大塊黑斑（圖3C），切開后亦能見到深褐至黑色斑（圖3D）。

圖1 甘薯莖腐病田間自然發病癥狀

圖2 甘薯莖腐病田間自然發病的葉子和葉柄發病的癥狀

圖3 甘薯莖腐病田間自然發病的根莖部及薯塊發病的癥狀

2.2 光學顯微鏡鏡檢

2.2.1 甘薯細菌性莖腐病鏡檢的最佳部位 在甘薯莖腐病初發病、中度發病和重度發病期，通過對莖、根、葉、葉柄各30 份以上樣本的顯微鏡鏡檢發現：初發病期，即莖部的水漬狀斑始現時，根、葉、葉柄部難以見到細菌溢，但莖部能清楚觀察到噴菌現象（表1）；中度發病時，除了莖部外，根部也觀察到噴菌現象，但在葉、葉柄部仍難見到；重度發病時，莖、根部能見噴菌現象，葉、葉柄部只有在其上顯現莖腐病病斑時才能見到噴菌現象，一般情況下，葉、葉柄部難以見到噴菌現象。通過對莖、根、葉、葉柄部位的鏡檢研究表明，莖部是顯微鏡鏡檢的最佳部位。

表1 甘薯植株不同部位的甘薯莖腐病細菌溢顯微鏡鏡檢結果

2.2.2 甘薯細菌性莖腐病鏡檢的最佳時期 上述研究明確了甘薯莖部是莖腐病菌聚集最多的地方，是鏡檢的最佳部位。但鏡檢的最佳時期在什么時候？從植物檢疫和防控的角度看，當然是越早越好，但必須考慮其有效性。由圖4我們發現甘薯莖腐在田間發生有明顯的發病中心，發病初期呈零星點狀分布，在初發病期甘薯病組織中會增殖大量的細菌，但尚無明顯癥狀，在清晨露水尚未散去前，可以從甘薯莖基部觀察到水漬狀斑（圖4A）。通過對甘薯莖部306份樣本的鏡檢表明，甘薯莖腐病初發病期的莖基水漬狀斑始現時，是鏡檢最佳和最有效時期，此時觀察到的噴菌現象非常清晰（圖4A、圖4B）。當把病莖橫切面碾碎時，在低倍顯微鏡下能觀察到大量的溢出的細菌（圖4C）。

圖4 甘薯莖腐病病莖初期癥狀的顯微鏡噴菌現象觀察

2.2.3 與其他甘薯莖基部腐爛病的區別 通過對306份甘薯莖腐病癥狀識別和顯微鏡鏡檢，我們能準確地診斷甘薯莖腐病。同時還能區分田間常見的真菌性甘薯莖基部腐爛病菌（圖5A），從圖5左邊類似甘薯莖腐病的病樣中，未鏡檢到細菌的噴菌現象，但能從莖部的橫切面鏡檢到大量的鐮刀菌(Fusariumsp.)大小分生孢子（圖5B），在80%這類樣本中能檢測到鐮刀菌，但有20%的樣本中檢測到交鏈孢子或其他真菌孢子[10]。這表明在杭州地區的莖基部腐爛菌除了甘薯莖腐病細菌外，主要是鐮刀菌[11]。

圖5 非莖腐病菌引起的甘薯病莖及顯微鏡觀察

2.3 光學顯微鏡鏡檢結果的驗證

對50 份病莖有噴菌現象的樣本做了分離鑒定，這些樣本中均能分離出D.dadantii病菌，兩者的符合率達100%；50 份病莖有噴菌現象的樣本經病菌分離后做了煙草過敏反應，它們均表現為陽性反應；50 份病莖有噴菌現象的樣本做了致病性測定，將它們接種于甘薯幼苗，癥狀與田間的基本一致，5～6 d 后全株腐爛、萎蔫死亡，49 份具有致病性，有一個樣本不發病，可能由于接種濃度偏底或病菌的致病力太弱，符合率為98%；30份病莖有噴菌現象的樣本樣做了脂肪酸分析，相似性系數接近或超過標準菌D.dadantiiLMG2534 和D.dadantiiLMG 2804 有30 份，符合率100%；30份病莖有噴菌現象的樣本做了PCR分析，結果與2 株甘薯莖腐病標準菌株和2 株菌(D.dadantiiCZ15001,D.dadantiiCZ15002)同源的30 份，符合率100%。這些都表明甘薯莖腐病癥狀識別加顯微鏡鏡檢的噴菌現象與這些傳統和分子生物學方法匹配的準確率在98%以上。（表2）。

表2 甘薯莖腐病病莖顯微鏡鏡檢結果的驗證

3 討論

甘薯莖腐病初期癥狀識別加顯微鏡鏡檢噴菌現象的方法是我們在多年的甘薯莖腐病植物檢疫中摸索出來，用于產地檢疫的一種新方法，國內外沒有這方面的報道。初期癥狀識別是植物病害檢疫常用的傳統方法，但至今沒有人與這最經典的植物細菌噴菌現象結合起來用于產地檢疫的報道。本研究除了明確顯微鏡鏡檢噴菌現象檢查的最佳時期和最佳部位外，還把這種方法與傳統的和分子生物學方法進行了比較。發現這是一種植物病害產地檢疫中準確、快捷、簡便的好方法。根據只要是植物細菌病害就能通過顯微鏡檢查到噴菌現象，而非細菌病害沒有這種現象這一植物細菌學原理。首先可以輕松地排除甘薯上多種病原真菌引起的病害，如甘薯莖基（枯）腐病，它可以由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、極細鏈格孢(Alternaria tenuissima)和齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起[10-11]；也可以由擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)、腐皮鐮刀菌(F.solani)、尖鐮刀菌(F.oxysporum)、性擬莖點霉(P.destruens)和爪哇鐮孢(F.javanicum)、甘薯間座殼菌(Diaporthe batatas)等6 種病原真菌引起[12-14]；據巴西2021年的報道，甘薯莖基（枯）腐病除了中國報道的病原真菌外還可以由其他病原真菌引起[15]。除了不少的病原真菌引起甘薯莖基（枯）腐病外，在中國北方的腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)可在甘薯莖部引起甘薯莖線蟲病[16]，而南方的根結線蟲(Meloidogynespp.)在廣東省引起甘薯根結結線蟲病[17]。通過鏡檢噴菌現象我們能輕松地排除這些眾多的甘薯莖基部真菌和線蟲病。但如鏡檢到噴菌現象，我們只能知道它是細菌病害，無法知道它是哪一種細菌病害。到目前為止從國內甘薯上分離到的病原細菌除了甘薯莖腐病菌(Dickeya dadantii) 外，還有甘薯瘟菌(Ralstonia solanacearum)[18-20]、巴西果膠桿菌(Pectobacterium brasiliense)[21]和瓜類果斑病菌(Acidovorax citrulli)[22]。但真正在國內田間流行的甘薯細菌病害只有甘薯莖腐病和甘薯瘟病，而后兩種病原細菌只是碰巧分離到，而且已經證實了瓜類果斑病菌不引起甘薯細菌病害[23]；巴西果膠桿菌在田間引起甘薯莖腐病也有待進一步驗證。目前國內已被證實并流行的甘薯細菌病害只有甘薯莖腐病和甘薯瘟病。雖然2種病害通過鏡檢噴菌現象無法區別，但可以通過初期的癥狀識別借以區分，甘薯瘟病苗期發病葉尖稍萎蔫、維管束變黃，后變褐色；成株期感染子葉萎蔫，根變細，小薯塊與莖基部變色、腐爛，輕拔易斷[24-25]。然而，如前所述，甘薯莖腐病沒有這些特征，可以通過癥狀識別與甘薯瘟病區分開。

根據前人的報道[26-27]，人工接種甘薯細菌性莖腐病菌在室內32℃高溫加70%以上高濕，5 d后薯苗全株腐爛死亡；32℃高溫時，如果濕度60%以下，病害發生明顯減緩，10 d 后只見黑色病斑沒有腐爛；27℃溫度時，濕度60%以下，10 d后只見黑色病斑也沒有腐爛；22℃溫度下在各種濕度時，10 d 后無任何病斑。這表明適宜的溫濕度是甘薯莖腐病發生的關鍵。這與筆者在田間觀測到癥狀情況基本一致。在適宜的溫濕度條件下，病害蔓延迅猛，甘薯莖腐病的田間自然發病癥狀從莖部水漬狀出現至全株死亡，一般為一星期左右。其中32℃的適溫及70%以上的濕度起了非常關鍵的作用，所以，根據甘薯莖腐病的癥狀特點，在防控上要及時發現苗期癥狀，在甘薯莖、葉柄和葉子的水漬狀初現期開始用藥保護，同時也是產地檢疫的最佳時期。圖2A的圖片很珍貴，在國內外未見到這種葉部水漬狀癥狀，因病害只在特別適宜的條件下才發生，發生的時間非常短，在高溫高濕的雨后難得一見，但次日馬上消失，緊接著葉片和葉柄上的水漬狀病斑干燥即轉成黑色干枯斑。甘薯莖腐的莖、葉柄和葉子的水漬狀初現期非常短，在田間出現的時間就1～2 d。有效地掌握這一關鍵時期是甘薯莖腐防控的關鍵。如果這時送當地有關實驗室鑒定檢測最快需3 d，而3 d 后甘薯莖腐防控的最適時間已錯過。但如果通過初期癥狀結合顯微鏡鏡檢10～20 min 就能知曉結果，不會耽誤甘薯莖腐病的最佳防控時期。

最后需要指出的是任何一種檢驗檢疫方法都不是十全十美的，有它的長處和短處，甘薯莖腐病的初期癥狀識別加顯微鏡鏡檢噴菌現象也一樣，只要植物有病原細菌的癥狀表現，就能見到噴菌現象，沒有假陽性，這是該方法的長處；但如果病菌在溫濕度不適宜時不表現癥狀，而是潛伏侵染，這時植物組織內的細菌量很少，無法見到噴菌現象，就會誤認為植株沒有被侵染、是健康的，這就是這一方法的短處，它的靈敏度難以與分子生物學方法相比較。而分子生物學方法雖然靈敏度高，但如果所用引物的特異性不強或病菌已死亡或失活就有可能產生假陽性。所以，如果條件允許，甘薯莖腐病的初期癥狀識別加顯微鏡鏡檢噴菌現象這一方法與分子生物學方法相結合是最保險的組合，因前者是直觀的，后者是靈敏的。

4 結論

自2015—2019年連續5年對田間甘薯莖腐病癥狀深入細致觀察與不同時段發病癥狀的比較，發現甘薯莖腐病可以發生在甘薯植物的葉、葉柄、莖及塊根上，但主要發生在莖基部。通過對甘薯莖部306份樣本的鏡檢表明，甘薯莖腐病初發病期的莖基水漬狀斑始現時，是鏡檢最佳和最有效時期。經對甘薯莖腐病發病輕、中、重的306 份莖部樣本的鏡檢及與根、葉和葉柄各90份樣本的顯微鏡鏡檢比較，明確了莖基部是顯微鏡鏡檢的最佳部位。甘薯莖腐病初期癥狀識別加顯微鏡鏡檢噴菌現象是植物病害產地檢疫中準確、快捷、簡便的好方法，它與分離鑒定、煙草過敏反應、致病性測定、脂肪酸分析、PCR測定比較的匹配準確率在98%～100%。