Hsa_circRNA_063981作為2型糖尿病診斷標(biāo)志物的初步研究

周黎琴，邊蓉，胡斐，樓大勇

·論 著·

Hsa_circRNA_063981作為2型糖尿病診斷標(biāo)志物的初步研究

周黎琴1，邊蓉1，胡斐2，樓大勇1

1.浙江省諸暨市人民醫(yī)院藥事部，浙江諸暨 311800；2.溫州醫(yī)科大學(xué)慈溪生物醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)管理中心，浙江慈溪 315302

分析Hsa_circRNA_063981在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者中的表達(dá)情況，了解其與臨床指標(biāo)和炎癥因子的相關(guān)性。選取2021年5月至10月于浙江省諸暨市人民醫(yī)院就診的40例T2DM患者納入T2DM組，選取同期40名健康體檢者納入對(duì)照組。比較兩組受試者的一般臨床資料、Hsa_circRNA_063981和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達(dá)水平，Pearson相關(guān)性分析Hsa_circRNA_063981與臨床指標(biāo)和炎癥指標(biāo)的相關(guān)性，繪制受試者操作特征曲線評(píng)估Hsa_circRNA_063981診斷T2DM的潛在價(jià)值。T2DM組患者的體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、空腹C肽均顯著高于對(duì)照組，空腹胰島素顯著低于對(duì)照組（0.05）。T2DM組患者的Hsa_circRNA_063981、IL-6表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（<0.05）。Hsa_circRNA_063981與空腹胰島素水平呈正相關(guān)（=0.397，=0.011），與IL-6無相關(guān)性。Hsa_circRNA_063981診斷T2DM患者的曲線下面積為0.610，敏感度和特異性分別為33.3%和87.23%。Hsa_circRNA_063981對(duì)T2DM具有一定的診斷價(jià)值。

Hsa_circRNA_063981；2型糖尿病；胰島素；白細(xì)胞介素-6

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）約占糖尿病的90%，主要表現(xiàn)為血糖升高、胰島素分泌不足和胰島素抵抗[1]。目前臨床上主要通過檢測(cè)血糖值來診斷糖尿病，有效生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和對(duì)潛在治療靶點(diǎn)的探索，是糖尿病診斷和治療的新方向。白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）是一種在多種疾病發(fā)生發(fā)展中均起重要作用的細(xì)胞因子，與炎癥、胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙有關(guān)[2-3]。研究顯示IL-6具有抗炎和改善葡萄糖代謝的作用[4]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類可形成共價(jià)閉合環(huán)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA[5]。鑒于circRNA的特殊性能，其在糖尿病、腫瘤、心力衰竭和帕金森病等疾病中均發(fā)揮重要作用[6-9]。研究證實(shí)circRNA與胰島素分泌和糖尿病發(fā)病機(jī)制相關(guān)，其中circRNA-CDR1可調(diào)節(jié)胰島素分泌和β細(xì)胞數(shù)量，Hsa_circRNA_0054633與糖基化相關(guān)，均可作為糖尿病前期或T2DM的潛在診斷標(biāo)志物[5]。本研究擬評(píng)估Hsa_circRNA_063981與T2DM之間的關(guān)系，為T2DM的早期診斷和治療尋找潛在的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年5月至10月于浙江省諸暨市人民醫(yī)院就診的40例T2DM患者納入T2DM組。納入標(biāo)準(zhǔn)：典型的糖尿病癥狀（煩渴多飲、多尿、多食、不明原因體質(zhì)量下降）加隨機(jī)血糖≥11.1mmol/L或空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）≥7.0mmol/L或葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)2h血糖≥11.1mmol/L或糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）≥6.5%。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并T2DM急慢性并發(fā)癥患者，如糖尿病酮癥酸中毒、高滲綜合征及T2DM導(dǎo)致的心腦血管疾病、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病足等；合并妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）、高血壓、肝腎綜合征和腫瘤患者；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）≥30kg/m2患者；吸煙患者。選取同期40名健康體檢者納入對(duì)照組。本研究經(jīng)浙江省諸暨市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：[2022]醫(yī)倫第（0107）號(hào)），所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般臨床資料收集 收集受試者的一般臨床資料，包括年齡、BMI、血壓、HbA1c、FBG、空腹C肽、空腹胰島素、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-L）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein- cholesterol，HDL-L）。

1.2.2 總RNA提取和互補(bǔ)DNA合成 收集受試者的空腹外周靜脈血3ml，12000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清，儲(chǔ)存于–80℃?zhèn)溆谩Ｊ褂肨RIZOL LS試劑（賽默飛，德國(guó)）從血清中分離總RNA。提取的總RNA使用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)純度，符合標(biāo)準(zhǔn)者用于反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。反轉(zhuǎn)錄條件：42℃ 50min，85℃ 5min。反轉(zhuǎn)錄完成后立即保存在–80℃冰箱。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 在以下條件下進(jìn)行：95℃初始變性5min，隨后94℃ 10s、引物特異性退火溫度20s、72℃ 30s，共45個(gè)循環(huán)，Hsa_circRNA_063981的退火溫度為55℃，β-肌動(dòng)蛋白的退火溫度為56℃。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè) 購(gòu)買IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（PI330，碧云天，中國(guó)）。按照試劑盒說明測(cè)定受試者血清IL-6水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者的臨床指標(biāo)比較

T2DM組患者的BMI、收縮壓、舒張壓、FBG、HbA1c、空腹C肽均顯著高于對(duì)照組，空腹胰島素顯著低于對(duì)照組（0.05），見表1。

2.2 兩組受試者的Hsa_circRNA_063981表達(dá)比較

T2DM組患者的Hsa_circRNA_063981表達(dá)顯著高于對(duì)照組（=0.013），見圖1。

2.3 T2DM患者Hsa_circRNA_063981水平與空腹胰島素的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hsa_circRNA_063981與空腹胰島素水平呈正相關(guān)（=0.397，=0.011），與其他臨床指標(biāo)均無相關(guān)性（>0.05），見圖2。

2.4 兩組受試者的IL-6水平比較

T2DM組患者的IL-6水平顯著高于對(duì)照組（<0.001），見圖3。

2.5 T2DM患者Hsa_circRNA_063981水平與血清IL-6的關(guān)系

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Hsa_circRNA_063981與IL-6之間無相關(guān)性（=0.098，=0.545），見圖4。

2.6 Hsa_circRNA_063981對(duì)T2DM患者的診斷價(jià)值

繪制ROC曲線，Hsa_circRNA_063981診斷T2DM患者的曲線下面積為0.610（95%：0.533～0.772，=0.019），敏感度和特異性分別為33.3%和87.23%，見圖5。

表1 兩組受試者的臨床指標(biāo)比較（）

注：1mmHg=0.133kPa

圖1 兩組受試者的Hsa_circRNA_063981表達(dá)比較

圖2 Hsa_circRNA_063981與空腹胰島素的相關(guān)性

圖3 兩組受試者的IL-6水平比較

圖4 Hsa_circRNA_063981與IL-6的相關(guān)性

圖5 Hsa_circRNA_063981診斷T2DM患者的 ROC曲線

3 討論

T2DM是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病，由胰島素分泌和（或）作用缺陷引起[10-11]。本研究選擇健康人群和T2DM患者作為研究對(duì)象，并對(duì)兩組的臨床生化指標(biāo)進(jìn)行比較。結(jié)果與既往研究一致，T2DM患者多為肥胖患者，BMI明顯高于健康人群。長(zhǎng)期高血糖可對(duì)患者的血管造成影響，使血管更易硬化，減弱血管的舒縮功能，因此T2DM患者的收縮壓和舒張壓均高于對(duì)照組。HbA1c主要用于評(píng)估T2DM患者既往2個(gè)月的血糖控制情況[12]；HbA1c越高，表明T2DM患者的血糖控制情況越差。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的HbA1c水平高于對(duì)照者，血糖控制不佳，應(yīng)接受降糖治療。此外，T2DM患者的FBG較高，提示其臨床治療方案有待完善。血清C肽水平反映胰島β細(xì)胞的儲(chǔ)備[13]。本研究發(fā)現(xiàn)T2DM患者的C肽高于對(duì)照組，說明T2DM患者需要儲(chǔ)備更多胰島素來降低升高的血糖。T2DM患者胰島功能受損，分泌胰島素能力下降，本研究證實(shí)T2DM患者的胰島素分泌下降。IL-6除具有免疫調(diào)節(jié)作用外，在T2DM的發(fā)生發(fā)展中也具有重要調(diào)節(jié)作用[14]。研究證實(shí)IL-6在代謝調(diào)節(jié)，尤其是葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[15]。

circRNA是一種新型的非編碼RNA，其表達(dá)水平是線性RNA的10倍[16]。因此，circRNA作為一種生物標(biāo)志物比線性RNA更有優(yōu)勢(shì)。作為一種常見的非編碼RNA，Hsa_circRNA_063981在哺乳動(dòng)物中廣泛表達(dá)，其可作為分子海綿調(diào)節(jié)信使RNA的基因表達(dá)，也可作為DNA和編碼蛋白之間的橋梁[17]。Gu等[17]通過微陣列描述多種circRNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）患者中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hsa_circRNA_063981在DR患者中高表達(dá)，與單純T2DM患者和健康對(duì)照人群相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在DR患者病理過程中起調(diào)節(jié)作用，為DR患者的治療提供新的見解，同樣為研究糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制提供新的研究方向。Wu等[18]比較正常孕婦和GDM孕婦血液中Hsa_circRNA_063981的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Hsa_circRNA_063981在妊娠晚期GDM孕婦中低表達(dá)。比較新生兒臍帶血中Hsa_circRNA_ 063981的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，GDM孕婦所生新生兒血液中Hsa_circRNA_063981高表達(dá)，且與其他circRNA存在相關(guān)性，可間接調(diào)節(jié)HbA1c和GDM孕婦血糖水平。以上研究均表明，Hsa_circRNA_063981與糖代謝和胰島功能存在相關(guān)性，可作為糖尿病和糖尿病相關(guān)疾病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，Hsa_circRNA_063981在T2DM患者中高表達(dá)，且Hsa_circRNA_063981與T2DM患者血清胰島素的分泌呈正相關(guān)，提示Hsa_circRNA_063981的表達(dá)與胰島β細(xì)胞的分泌功能相關(guān)。Dai等[19]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的Hsa_circRNA_0054633與炎癥因子IL-17和腫瘤壞死因子-α相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)IL-6在T2DM患者中高表達(dá)，但與Hsa_circRNA_063981無相關(guān)性，其原因需進(jìn)一步分析。ROC曲線評(píng)估Hsa_circRNA_ 063981對(duì)T2DM患者的診斷價(jià)值，曲線下面積為0.610，具有一定的診斷意義，但診斷價(jià)值偏低。

綜上，Hsa_circRNA_063981在T2DM患者中高表達(dá)，與血清胰島素呈正相關(guān)，但與炎癥指標(biāo)IL-6無相關(guān)性，可作為診斷T2DM的潛在血清生物標(biāo)志物。

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Preliminary study of Hsa_circRNA_063981 as a diagnostic marker for type 2 diabetes mellitus

ZHOU Liqin, BIAN Rong, HU Fei, LOU Dayong

1.Department of Pharmaceutical Affairs, Zhuji People’s Hospital of Zhejiang Province, Zhuji 311800, Zhejiang, China; 2.Experimental Management Center, Cixi Institute of Biomedicine, Wenzhou Medical University, Cixi 315302, Zhejiang, China

To investigate the expression of Hsa_circRNA_063981 in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and its correlation with clinical indicators and inflammatory factors.A total of 40 T2DM patients treated in Zhuji People’s Hospital of Zhejiang Province from May to October 2021 were included in T2DM group, and 40 healthy physical examination subjects were included in control group during the same period. The general clinical data, expression levels of Hsa_circRNA_063981 and interleukin-6 (IL-6) were compared between the two groups, and the correlation between Hsa_circRNA_063981 and clinical and inflammatory indicators was analyzed by Pearson correlation analysis. The potential value of Hsa_circRNA_063981 in the diagnosis of T2DM was evaluated by drawing receiver operating characteristic curve.The body mass index, systolic blood pressure, diastolic blood pressure, fasting blood glucose, glycosylated hemoglobin and fasting C-peptide in T2DM group were significantly higher than those in control group, and fasting insulin was significantly lower than that in control group (<0.05). The expressions of Hsa_circRNA_063981 and IL-6 in T2DM group were significantly higher than those in control group (<0.05). Hsa_circRNA_063981 was positively correlated with fasting insulin level (=0.397,=0.011), but not with IL-6. The area under the curve of Hsa_circRNA_063981 for T2DM diagnosis was 0.610, and the sensitivity and specificity were 33.3% and 87.23%, respectively.Hsa_circRNA_063981 is valuable in the diagnosis of T2DM.

Hsa_circRNA_063981; Type 2 diabetes mellitus; Insulin; Interleukin-6

R587.1

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.19.009

寧波市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2021J031）

樓大勇，電子信箱：dayonglou@163.com

（2022–09–23）

（2023–06–15）