種子表型平臺的改進及其在芥菜種子活力研究中的應用

陸光遠, 游永全, 劉羽婷, 李春生, 韋明肯, 歐陽樂軍, Steven Penfield, 趙永國

(1.廣東石油化工學院生物與食品工程學院, 廣東 茂名 525000; 2.湖北工程學院, 湖北 孝感 432000;3.Department of Crop Genetics,John Innes Centre,Norwich NR4 7UH,UK)

葉用芥菜是我國重要的大宗蔬菜,主要包括大葉芥菜、花葉芥菜、瘤柄芥菜、包心芥菜和分蘗芥菜等多種類型[1],在華南地區(qū)常見的芥菜類型包括大葉芥、多裂葉芥、皺葉芥菜、包心芥和水東芥等,其中水東芥菜是以產(chǎn)地賦名的嶺南特色名優(yōu)蔬菜,屬于十字花科蕓薹屬的葉用芥菜(BrassicajunceaL. Coss. var. folosa Bailey,2 n=4 x=36)。水東芥菜歷史悠久,主要分布在粵西地區(qū),具有小卷心、莖多葉少、爽脆可口、質(zhì)嫩無渣、鮮甜味美等特點,深受國內(nèi)和港澳地區(qū)市場歡迎,2007年獲得中國國家地理標志產(chǎn)品保護[2]。隨著華南地區(qū)工業(yè)化的完成,農(nóng)村勞動力成本大幅提高,當前大田蔬菜生產(chǎn)方式正由傳統(tǒng)的勞動密集型向規(guī)模化、機械化生產(chǎn)發(fā)展,通過機械精量播種,可實現(xiàn)一播成苗,避免育苗移栽,從而省工省時,大幅度降低蔬菜生產(chǎn)成本。高活力種子能夠顯著提高田間出苗率、抵御不良環(huán)境條件、增強抗性,是實現(xiàn)精量播種、一播全苗的前提。目前關于芥菜種子活力的研究報道較少。

土壤鹽堿化是制約現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素之一。我國鹽堿地近1億hm2,廣泛分布在內(nèi)陸和沿海地帶,其中華南沿海的鹽害類型以氯化鈉為主[3]。葉用芥菜作為嶺南地區(qū)的重要蔬菜,播種和出苗期受到鹽堿地的影響嚴重。因此,開展芥菜耐鹽堿性研究,提高種子活力,特別是大田直播條件下芥菜種子萌發(fā)和出苗期的耐鹽堿性,對于保障我國蔬菜供給安全具有重要意義。

種子萌發(fā)是植物生長的第一步,需要在充足的水分、空氣和適宜的溫度下進行,其過程可分為吸脹、萌動、發(fā)芽和成苗四個階段;種子必須從外界環(huán)境吸收足夠的水分才能啟動一系列酶的活動,開始萌發(fā);當環(huán)境水勢低于某個臨界值時,種子因無法吸收足夠水分而停止萌發(fā)[4]。近十年來,種子萌發(fā)期耐鹽性的鑒定已有較多報道,裴毅等[5]分析了白芥種子在不同鹽濃度和NaHCO3脅迫下的耐受性;龍衛(wèi)華等[6]比較了3種油菜萌發(fā)期間的耐鹽性差異;蹇黎等[7]研究了Na2CO3脅迫對野生油菜種子萌發(fā)的影響。在芥菜中,崔世友,張蛟蛟[8]通過灘涂種植和根際土壤電導率測定,鑒定出了強耐鹽的野生葉用芥菜材料。王潔等[9]對5個芥菜品種的耐鹽性進行綜合評價,認為發(fā)芽期耐鹽性大小依次為甬雪4號、甬雪3號、甬雪1號、科興雪菜、大豐雪菜。

通過數(shù)學建模可以深入研究種子的萌發(fā)特性。盡管采用經(jīng)驗的數(shù)學模型(比如Hill函數(shù))也可以擬合種子萌發(fā)過程,但由于模型中沒有引入溫度、水分等環(huán)境變量,因此無法分析和預測外界因素對種子萌發(fā)的影響,也不利于開展遺傳機理研究[4]。另外,基于群體閾值的數(shù)學模型,比如積水(Hydrotime,HT)、積溫(Thermal time,TT)和積溫水(Hydrothermol time,HTT)模型,由于這些模型中引入了環(huán)境溫度T、水勢Ψ等變量,因而可以定量分析種子萌發(fā)對溫度、水分脅迫的響應[10-12]。最近,有研究人員進一步提出了積鹽(Halothermal time, HaloTT)模型,用以動態(tài)描述鹽脅迫下種子萌發(fā)速度與鹽濃度之間的函數(shù)關系[13-14],即:

θHalo=(NaClb(g)-NaCl)tg

(1)

式中,θHalo為常數(shù),NaCl為氯化鈉介質(zhì)濃度,NaClb(g)為種子萌發(fā)百分率為g時所能夠忍受的最高NaCl濃度,tg為種子萌發(fā)百分率達到g所需要的時間。利用上述函數(shù),可以精確預測芥菜種子在鹽脅迫下的萌發(fā)動力學特性,為研究芥菜高活力種子的遺傳機理奠定基礎。

本研究在參照前人工作的基礎上,改進并構建了新一代的低成本、高通量種子表型平臺,可實現(xiàn)無人值守運行,同時利用該平臺對芥菜發(fā)芽期耐鹽性進行了定性和定量分析,旨在為芥菜耐鹽品種的選育和栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗材料為芥菜種子,購自陽春農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料公司,可在華南沿海地區(qū)種植。

1.2 種子表型平臺構建

參照Colmer等[15]的方法,改進并構建了一個種子表型平臺SeedGerm V 2.0(圖1 a),主要硬件包括:1個透明的塑料盒(長47 cm×寬34 cm×高29 cm),1個USB接口微型霧化器,1臺卡片式微型電腦(樹莓派)及其配套的攝像頭,按當前市場價其成本不足1 000元,一次可分析小粒種子(芥菜、油菜、辣椒等)300粒或大粒種子(玉米、大豆等)100粒。后期的圖像存儲和數(shù)據(jù)分析可在普通的辦公電腦進行。發(fā)芽箱底部放置一張藍色的發(fā)芽濾紙(可用藍色吸水棉布代替),藍色與種皮顏色反差較大,有利于后期的圖像數(shù)據(jù)處理分析。噴霧裝置用定時開關控制,以便維持發(fā)芽箱的恒定濕度,省去了種子發(fā)芽過程中的人工補水程序,可實現(xiàn)全過程無人值守,提高工作效率(圖1 b)。

注:a為種子平臺總體結構;b為發(fā)芽盒俯視圖。圖1 新一代種子表型平臺SeedGerm V 2.0Fig.1 New generation of seed phenotyping platform SeedGerm V 2.0

1.3 種子發(fā)芽實驗

分別配制5個梯度的NaCl溶液(0,0.075,0.150,0.225 mol/L和0.300 mol/L),模擬不同鹽脅迫環(huán)境。發(fā)芽紙平鋪在托盤上,加入相應的NaCl溶液30 mL浸泡20 min,使其充分濕潤。挑選健康、飽滿、無損傷的芥菜種子,先用3%次氯酸鈉消毒10 min,然后蒸餾水反復沖洗干凈,之后用鑷子將種子均勻地擺放在發(fā)芽紙上,每個處理50粒,3次重復。托盤放入種子表型平臺,啟動程序,開展萌發(fā)實驗。每天檢查發(fā)芽情況,并利用微型噴霧器定時補水保濕,發(fā)芽試驗總天數(shù)設置為8 d,人工判讀的發(fā)芽標準為種子胚根突破種皮1.5 mm。

1.4 發(fā)芽圖像采集與處理

在種子發(fā)芽過程中,首先利用樹莓派控制的攝像頭自動定期(比如1張/h)抓拍圖片,實驗結束后將所有圖片通過網(wǎng)絡輸入計算機。當圖像采集程序開始運行后,盡量不再移動發(fā)芽箱的位置,否則可能影響拍攝質(zhì)量,不利于后期對結果進行分析。人工刪除曝光不足(晚上拍攝)的圖片,同時對圖像進行適當?shù)牟眉艉蛯Ρ榷日{(diào)整,最后將系列圖像導入軟件SeedGerm(https://github.com/Crop-Phenomics-Group/SeedGerm/releases)中運行,可自動獲得發(fā)芽率、平均發(fā)芽時間等數(shù)據(jù)。

1.5 種子萌發(fā)參數(shù)估算

將種子表型平臺輸出的種子發(fā)芽數(shù)據(jù)導入MS Excel 2019軟件,利用Hill函數(shù)進一步進行曲線擬合,計算獲得T50(發(fā)芽率達到最大值一半所需的時間)、U2575(發(fā)芽率達到75%與25%所需時間之差)、AUC(發(fā)芽曲線面積)、MGT(平均萌發(fā)時間)等種子萌發(fā)動力學參數(shù),可以比較種子在不同鹽脅迫環(huán)境下的種子活力、整齊度、一致性的變化情況,從而評價種子萌發(fā)期的耐鹽性。

1.6 積鹽模型的構建與預測

由于Hill函數(shù)沒有引入鹽濃度等關鍵參數(shù),因而無法對不同鹽脅迫下的種子萌發(fā)情況進行分析和預測。為此,進一步利用HaloTT模型分析發(fā)芽數(shù)據(jù)。通過公式(1)變換后得到公式(2),其生物學含義更加直觀,即種子萌發(fā)速度GR與鹽濃度NaCl呈線性關系,其斜率的倒數(shù)即為θHalo:

GR=1/tg=[NaClb(g)- NaCl]/θHalo

(2)

其中:θHalo為積鹽常數(shù);NaCl為種子開始萌發(fā)的NaCl介質(zhì)濃度;NaClb(g)為基礎鹽濃度,即種子萌發(fā)時能夠忍受的最高NaCl濃度,該值與發(fā)芽百分比g有關,近似服從正態(tài)分布;tg為達到種子萌發(fā)百分率g所需要的時間;1/tg為萌發(fā)速率GR。利用Origin 2018軟件進行線性回歸分析,可估算參數(shù)θHalo和NaClb(g)。由于種子萌發(fā)曲線近似于正態(tài)分布,因此通過probit轉(zhuǎn)換可將曲線轉(zhuǎn)化為直線,以便估算參數(shù):

Probit(g)=[NaCl+θHalo/tg-NaClb(50)]/δNaClb

(3)

在上述公式中,NaClb(g)服從正態(tài)分布,其平均值為NaClb(50)(即種子萌發(fā)率為50%時所能忍受的最高NaCl濃度),標準方差為δNaClb[14]。

2 結果與分析

2.1 種子發(fā)芽動態(tài)檢測

利用改進后的種子表型平臺SeedGerm V 2.0,在5種不同NaCl濃度脅迫下分別進行芥菜種子萌發(fā)實驗(圖2 a)。每次發(fā)芽實驗設置3個重復(50粒/重復),種子放置在發(fā)芽紙(布)上,成像間隔為1 h,共采集了192張圖像,歷時8 d。可以看出,種子發(fā)芽120 h后,在低濃度的NaCl中,幾乎所有種子都能夠發(fā)芽,而且胚芽較長;而在中等和高濃度鹽脅迫下,發(fā)芽率明顯下降,甚至不能萌發(fā)(圖2 a)。種子平臺軟件通過對大量圖片的處理和分析(圖2 b),可直接輸出累積萌發(fā)曲線,T30、T50、T70發(fā)芽時間(可用來評價萌發(fā)的整齊度),以及Gmax(試驗結束時種子的最終發(fā)芽率)(圖2 c)。此外,軟件還自動生成了須盒圖(示例中展示了T50的統(tǒng)計離散性),以方便評估發(fā)芽的均勻性或變異性。最后,軟件還提供了不同時間點所有種子萌發(fā)數(shù)據(jù)的Excel文件,以便對所有數(shù)據(jù)進行整合后進一步統(tǒng)計分析。

2.2 種子表型平臺的可靠性

為了驗證種子表型平臺及圖像分析軟件Seed Germ的可靠性,對芥菜種子在正常條件下的發(fā)芽圖像進行軟件識別和人工統(tǒng)計,并比較兩者的異同。結果表明,SeedGerm軟件生產(chǎn)的種子萌發(fā)數(shù)據(jù)與人工統(tǒng)計結果整體上的發(fā)芽率增長趨勢基本一致,但是軟件生產(chǎn)的種子萌發(fā)數(shù)據(jù)折線圖整體略為滯后于人工統(tǒng)計的種子萌發(fā)結果(圖3),這可能是由于判定種子萌發(fā)的標準差異造成的。軟件將種子的體積增長超過10%判定為發(fā)芽,而人工的判斷標準是胚根長度達到1.5 mm或種子直徑的一半。進一步計算了軟件生成和人工判讀發(fā)芽數(shù)據(jù)的相關性,結果發(fā)現(xiàn)其相關系數(shù)為 0.988,達到極顯著水平(p<0.001),表明種子平臺具有較高的可靠性和準確性,適合開展芥菜種子活力研究。

圖3 SeedGerm生產(chǎn)和人工統(tǒng)計的芥菜種子發(fā)芽率比較Fig.3 Comparison of mustard seed germination rate obtained by SeedGerm and artificial counting

2.3 芥菜種子對鹽脅迫的響應

由圖4可知,對照的發(fā)芽情況較好,發(fā)芽44 h后發(fā)芽率即達到100%。在極低鹽濃度(0.075 mol/L)條件下,種子的萌發(fā)不但沒有受到抑制,反而具有一定的促進作用,實驗開始12 h后發(fā)芽率為28%,高于對照的20%,表明適量的NaCl是維持植物生長發(fā)育所必需的,其最終發(fā)芽率與對照相近。隨著鹽濃度的升高,種子發(fā)芽開始受到明顯影響,在0.150 mol/L條件下,種子的最終發(fā)芽率降低到80%,同時達到最終發(fā)芽率所需時間延長到60 h左右;在中度(0.225 mol/L)鹽脅迫下,種子的發(fā)芽率僅有40%,達到最終發(fā)芽率的時間繼續(xù)推遲到80 h左右;而在重度(0.300 mol/L)鹽脅迫下種子基本喪失了發(fā)芽能力,同時達到最終發(fā)芽率所需時間>100 h(圖4)。由此可見,極低濃度的鹽能夠促進發(fā)芽,但隨著濃度的升高,種子的發(fā)芽受到抑制,且可以明顯看出種子萌發(fā)率、萌發(fā)速度均與NaCl濃度成反比。

注:發(fā)芽率為均值±標準差(n=3)。圖4 不同NaCl濃度下芥菜種子萌發(fā)曲線Fig.4 Germination curve of mustard seeds under different NaCl concentrations

2.4 芥菜種子的萌發(fā)動力學分析

利用Hill函數(shù)對芥菜種子在不同鹽濃度下的種子萌發(fā)曲線進行擬合,并求算出最終發(fā)芽率、T50、Gmax(h)、U7525(h)、AUC、MGT等特征參數(shù)(表1),以便比較不同基因型芥菜的耐鹽性差異。

表1 不同NaCl脅迫下的種子萌發(fā)參數(shù)Table 1 Germination parameters of mustard seeds under different NaCl stresses

T50為達到最高萌發(fā)率一半所需的時間,時間越短,表明種子活力越高。在NaCl濃度為0 mol/L的條件下芥菜種子的T50值較小(14.2 h),表明供試品種的種子活力很強,14 h左右即有一半種子萌發(fā);隨著鹽濃度的升高,總體上T50值也逐漸變大,但在0.075的極低濃度條件下,T50值不升反降,僅為12.5 h,再次說明極低濃度的鹽溶液能夠促進種子萌發(fā),加快發(fā)芽速度。當鹽濃度為0.15～0.225 mol/L時,T50顯著增大到30 h左右,而在NaCl濃度為0.300 mol/L的條件下芥菜種子的T50值最大,為56.8 h,表明種子發(fā)芽嚴重受阻。

U7525是指達到發(fā)芽率75%與25%所需時間的差值,該值越小,表明種子的萌發(fā)一致性和整齊度越好。可以看出,在水或低鹽濃度下,芥菜種子的U7525在3.0～10.6 h之間,數(shù)據(jù)較小,說明發(fā)芽的一致性較高,而NaCl濃度為0.225 mol/L時,U7525急劇上升到23.8 h,說明高濃度鹽溶液延緩了發(fā)芽,并且發(fā)芽整齊度較差;當鹽濃度上升為0.300 mol/L時,U7525值又降低至5.6 h,這是由于高鹽脅迫下種子總體的發(fā)芽率較低、變異較小造成的。

AUC是指種子萌發(fā)曲線下的面積,能更加全面、綜合地反映種子萌發(fā)的質(zhì)量,AUC值越大,表示種子萌發(fā)的速度越快、質(zhì)量越好。在對照和極低鹽濃度條件下,芥菜種子的AUC值在179%/h以上,表明種子活力最強,在中等鹽濃度條件下(0.15 mol/L),AUC值降低到135.5%/h;在高鹽條件下(0.225～0.300 mol/L)AUC值僅有67%/h以下,表明其種子活力較差。由此可見,AUC值十分靈敏,適合于作為逆境脅迫下種子活力鑒定的重要指標。

MGT是指所有種子完成萌發(fā)所需時間的平均值,MGT值越小,說明種子萌發(fā)的速度越快,種子活力越高。MGT的變化趨勢與T50相似,即鹽濃度越高,種子平均萌發(fā)時間就越長,該種環(huán)境條件下種子的活力就越低(表1)。

2.5 鹽脅迫下種子萌發(fā)的積鹽模型及預測

芥菜種子的萌發(fā)曲線為“S”型曲線,近似服從正態(tài)分布的累積函數(shù),通過Probit轉(zhuǎn)換可以轉(zhuǎn)化為直線,方便模型擬合和參數(shù)估算。在本研究中,利用公式(3)對不同鹽濃度下的芥菜種子的種子萌發(fā)數(shù)據(jù)進行了擬合,構建了以鹽濃度(X)為自變量、種子發(fā)芽率(Y, probit轉(zhuǎn)換)為因變量的預測模型(公式):

Y=-14.993X+3.289

(4)

上述預測模型的決定系數(shù)R2為0.923,達極顯著水平(p=0.008),說明曲線擬合效果良好(圖5)。擬合后得到積鹽常數(shù)θhalo為2.26 mol/(L·h);根據(jù)上述線性方程的斜率和截距,可以進一步求得NaClb(50)為0.22 mol/L,其標準方差δNaClb為0.067 mol/L。利用這些參數(shù),得到鹽脅迫下發(fā)芽率的預測方程為:

圖5 Halothermal time模型回歸分析芥菜種子的萌發(fā)Fig.5 Regression analysis of Halothermal time model for mustard seed germination

Probit(g)=(NaCl+2.26/tg-0.22)/0.067

(5)

利用公式(5)可以預測在一定范圍內(nèi)不同鹽濃度下芥菜種子的種子發(fā)芽率。比如,利用預測模型計算芥菜種子在上述5個NaCl濃度梯度下的預測發(fā)芽率,結果發(fā)現(xiàn),預測結果與實驗數(shù)據(jù)較為吻合,決定系數(shù)R2在0.867～0.963之間,說明預測效果良好。

3 討論與結論

種子不僅是重要的食物來源,也是最重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料。種子質(zhì)量對作物產(chǎn)量具有決定性作用[16],因此開展種子活力研究十分必要。長期以來,種子發(fā)芽實驗基本靠人工進行,不僅工作量大,勞動強度高,而且效率低、周期長,還容易受到實驗人員主觀因素的影響,因而限制了種子科學研究的規(guī)模和準確性[17]。 近十年來,隨著植物表型組學的快速發(fā)展,一些適用于種子萌發(fā)和幼苗活力研究的表型平臺已經(jīng)涌現(xiàn),比如Germinator、MultiSense、PhenoSeeder、SeedAIXPERT 和 SAGA等[18-22],這些技術平臺雖然技術先進,但由于成本高昂、技術復雜、通量低,普通實驗室難以獲得,因而其應用僅僅局限在少數(shù)的國家研究中心或跨國種業(yè)公司手中。為此,Colmer等[15]開發(fā)了低成本、高通量、易拓展的SeedGerm種子表型平臺,十分適合普通實驗室和種子公司使用。但該平臺在使用過程中,需要頻繁打開帶有攝像頭的發(fā)芽箱蓋子進行人工補充水分,操作十分繁瑣,很容易使攝像頭位置變動,造成拍攝的圖像位移,給后續(xù)的圖像處理帶來困難。為此,在發(fā)芽盒內(nèi)部添加了微型噴霧裝置(圖1),可定期自動加水,無須人工干預,從而實現(xiàn)了無人值守運行,工作效率進一步提高,效果良好。利用該平臺分析了芥菜種子在不同鹽脅迫下的種子發(fā)芽情況,發(fā)現(xiàn)機器判讀的發(fā)芽數(shù)據(jù)與人工統(tǒng)計結果十分接近,相關性達到極顯著水平,充分說明該發(fā)芽平臺的可靠性(圖2)。盡管如此,該平臺仍然存在一些不足,比如樹莓派的攝像頭較小,分辨率和景深有限,如果種子過小(擬南芥種子),則難以獲得足夠清晰的圖像;在補水過程中,噴霧器噴灑出來的水分同樣會使樹莓派的鏡頭模糊不清,影響拍攝圖像質(zhì)量。

種子在大田條件下很容易受到溫度、水分、鹽堿等環(huán)境因素的影響[23],而且隨著全球氣候變暖,未來干旱、炎熱和鹽堿化將進一步加劇,因此需要有一個種子萌發(fā)預測模型,以便在生產(chǎn)前進行規(guī)劃和決策[24]。油菜種子發(fā)芽率會隨著鹽度的增加而下降,濃度達到250 mmol/L時完全停止發(fā)芽[25],這種發(fā)芽率降低通常與較低的滲透勢和離子毒性有關[26]。以往研究表明,鹽脅迫通過改變酶活性、破壞細胞膜和細胞器,破壞參與發(fā)芽的生物分子的結構和功能來影響種子活力[27]。種子吸收鹽離子的能力取決于細胞膜的通透性,通過調(diào)節(jié)其內(nèi)部滲透勢,可以增加胚胎膨壓,使種子可在較低的水勢下萌發(fā)[14]。

HaloTT模型可以表征一個種子群體在萌發(fā)過程中的平均表現(xiàn)(即NaClb(50))以及個體之間的變異(即σNaClb);NaClb(50)下降的原因可能是細胞膜完整性喪失,其證據(jù)之一是種子浸出液的電導率值增加[23]。而且具有更大NaClb(50)和σNaClb的種子群體可以在更多和更復雜的逆境脅迫環(huán)境下萌發(fā)[28]。因此,種子群體閾值NaClb(50)可作為有效預測發(fā)芽時間或決定種子活力的指標[29]。通過記錄種子在一系列環(huán)境條件下的發(fā)芽時間,并計算種子萌發(fā)模型閾值等參數(shù),可以預測該種子群體的發(fā)芽率和時間[30]。Liu等[23]以13個一年生沙漠物種為研究材料,在實驗室采集發(fā)芽數(shù)據(jù),構建HaloTT模型,可準確描述和預測該物種在相同棲息地的發(fā)芽時機和發(fā)芽率。本研究初步構建了HaloTT模型,可以準確預測芥菜種子在實驗模擬鹽脅迫條件下的種子發(fā)芽率(圖6),但能否預測大田的發(fā)芽情況還需要開展更多的野外實驗。

注:線為模型預測值,點為實驗測定值。圖6 利用Halothermal time模型預測芥菜種子在不同NaCl濃度脅迫下的萌發(fā)情況Fig.6 Prediction of germination under different NaCl concentration for mustard seeds using Halothermal time model

綜上,本研究利用種子表型平臺,能夠準確記載種子萌發(fā)的動態(tài)過程并自動生成發(fā)芽數(shù)據(jù),在此基礎上進一步利用基于群體閾值的數(shù)學模型,對鹽脅迫下芥菜種子的萌發(fā)動力學進行定量分析,構建了一個可準確預測一定范圍內(nèi)不同鹽脅迫條件下的芥菜種子發(fā)芽率,從而為芥菜大田生產(chǎn)提供決策依據(jù)。