基于SSR分子標記的多花水仙資源遺傳多樣性分析

田奇琳, 何炎森, 敬月美, 余惠文, 朱 旸, 陳鄭鑌, 陸鑾眉

(1.閩南師范大學,閩臺特色園林植物福建省高校重點實驗室, 福建 漳州 363000;2.福建省農業科學院亞熱帶農業研究所, 福建 漳州 363005)

水仙(Narcissus)屬于石蒜科水仙屬多年生草本植物,主要分布于歐洲和地中海沿岸等地,其單株花量大,具有特殊香味,具有較高的觀賞價值和藥用價值[1-3]。英國皇家園藝學會將水仙分為1個植物學分類和12個園藝學分類:喇叭水仙、大杯水仙、小杯水仙、重瓣水仙、三蕊水仙、仙客來水仙、丁香水仙、多花水仙、紅口水仙、圍裙水仙、副冠開裂水仙和其他[4]。中國水仙(Narcissus.tazettavar.chinensis)屬法國多花水仙中的變種,為中國著名的十大傳統名花之一,主要分布在東南沿海一帶,按地區劃分有漳州水仙、崇明水仙、舟山水仙等,其中漳州水仙最具代表性[5-6]。盡管目前國內針對水仙屬種質資源的資源分布、遺傳多樣性、引種試種等方面進行了大量研究,總體開發利用仍較為薄弱。福建農林大學園藝學院選育出3個多花水仙特色新品種“黃花2號”[7]、“云香”[8]和“金玉”[9];王金英[10]以引進的20個歐洲水仙品種為試驗材料,調查歐洲水仙在福州地區的生長繁殖情況和環境適應性,進行了形態學、解剖學方面的研究,并將研究結果應用于水仙屬植物的分類比較;何炎森等[11]對多個多花水仙品種進行露地栽培并比較其物候期和觀賞性狀。目前國內水仙品種極度匱乏,生產上栽培的中國水仙,主要為“金盞銀臺”和“玉玲瓏”,品種多樣性不足;長期的無性繁殖導致水仙存在著病毒侵染、品質退化等問題[12]。此外,培育水仙新品種較為困難,中國水仙栽培品種為三倍體,利用傳統的雜交育種等方法難以獲得新品種[13];水仙缺乏全基因組數據,且組織培養植株再生率普遍較低,遺傳轉化率低,性狀改良瓶頸凸顯[14-15]。引進適合國內氣候下栽培的水仙資源以豐富國內水仙類型和優良育種親本資源是水仙種質資源創新的首要任務。因此,開展國內外水仙種質資源遺傳多樣性研究十分必要。

DNA分子標記技術是植物遺傳多樣性研究和資源親緣關系鑒定的重要手段之一。目前,RAPD標記[16-18]、ISSR[19-20]、AFLP[21-22]分子標記技術在水仙屬植物遺傳多樣性研究方面均有應用。簡單序列重復(Simple Sequence Repeats, SSR),又稱微衛星DNA(Microsatellite DNA),是一段由幾個核苷酸為單位的重復DNA序列,廣泛分布于生物基因組中;SSR標記遵循孟德爾共顯性遺傳模式,具有多態性較高、重復性高等許多優點,是遺傳多樣性分析中常用的分子標記技術之一[23-24]。隨著高通量測序技術的快速發展,SSR標記的開發與應用將極大推進植物分子育種研究。SSR分子標記作為水仙屬植物遺傳多樣性和種質資源鑒定的重要分子標記,目前在水仙屬植物遺傳多樣性研究方面已有少數應用。祁世明等[24-25]建立并優化了水仙的SSR-PCR反應體系,從開發的引物中篩選SSR標記引物,對引物的多態性、重復性等進行了驗證,并對部分水仙資源進行了遺傳多樣性研究。劉洋[26]利用“云香”水仙不同花期轉錄組數據設計了SSR標記引物,并進行可靠性檢測。目前真正得到推廣利用的水仙資源仍極少。鑒于此,本研究基于前期收集、保存和引進栽培的多花水仙種質資源,應用SSR分子標記技術開展國內外多花水仙種質資源遺傳多樣性研究,旨在為水仙傳統育種結合生物技術育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗材料多花水仙資源采自福建省農業科學院亞熱帶農業研究所的水仙花資源圃,具體信息見表1。

表1 多花水仙資源Table 1 Narcissus tazetta resources

試劑:丙烯酰胺,脲,Tris-base,N,N-甲叉雙丙烯酰胺,硼酸,EDTA(乙二胺四乙酸二鈉),TEMED(四甲基乙二胺),冰醋酸,95%乙醇,過硫酸銨(APS),反硅化劑,硅化劑,無水碳酸鈉,硝酸銀,氫氧化鈉,甲醛溶液,二甲苯青,甲酰胺,溴酚藍等。

1.2 儀器設備

高速離心機,水浴鍋,通風櫥,微波爐,超微量紫外分光光度計,電泳儀、PCR擴增儀等。

1.3 實驗方法

1.3.1DNA提取

采用上海惠凌生物科技有限公司的新型植物基因組DNA快速提取試劑盒提取,操作參照說明書。提取21個多花水仙資源的DNA,通過超微量分光光度計的測定,將A260/A280值在1.8～2.0的DNA樣品,用瓊脂糖電泳再檢測DNA完整性。最后將合格的DNA樣品稀釋終濃度至100 ng/μL,保存備用。

1.3.2SSR-PCR 擴增

將提取的多花水仙資源DNA作為模板,進行SSR-PCR 擴增,對SSR引物進行篩選。本研究中,引物CATACA 5、TA 34、TCA 9、AT 15選自祁世明等[25]的研究,引物NtSSR 2、NtSSR 4、NtSSR 12、NtSSR 13、NtSSR 18、NtSSR 19選自劉洋[26]的研究,引物Xgwm 469選自袁菊紅[27]的研究(表2);另外,基于中國水仙“玉玲瓏”轉錄組數據,進一步開發新的SSR標記引物,引物委托廈門擎科生物技術有限公司合成。PCR擴增程序為:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性30 s,49～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s進行35個循環,72 ℃延伸5 min。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3.3聚丙烯凝膠電泳

聚丙烯凝膠電泳參照余惠文等[28]的方法進行。將水仙DNA的PCR擴增產物變性后加入預電泳好的膠孔中,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結果拍照保存,讀取條帶用于后續相關分析。

1.3.4數據統計與分析

將聚丙烯酰胺凝膠電泳數據錄入NTsys-pc 2.10 e軟件,對21份多花水仙資源進行主成分分析和非加權算術平均聚類(UPGMA)分析。使用Popgen 32軟件計算引物多態性百分率、觀測等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei’s遺傳多樣性指數(H)和Shannon信息指數(I)。

2 結果與分析

2.1 引物多態性分析

基于“玉玲瓏”水仙轉錄組數據,從新設計的32對引物中通過SSR-PCR篩選得到6對SSR標記引物用于本研究,分別為N 10、N 16、N 21、N 22、N 24、N 32(表3)。結合前人研究,最終從76對引物中篩選出17對擴增的條帶清晰且有多態性的引物(表2和表3)。利用POPGEN 32軟件進行各項遺傳參數分析,17對SSR引物在21份水仙資源中共擴增出106個位點,其中有99個多態性位點,多態性位點比例為93.40%,表現為較高的多態性水平。每對引物產生的位點數在2～12之間,平均每對引物擴增出6.2個位點和5.8個多態性位點。17對引物的Nei’s遺傳多樣性指數為0.266 7,Shannon信息指數為0.411 7(表4),這17對引物中有3個引物的觀測等位基因數在1～2之間,其余14個的觀測等位基因數均是2。新開發的6對SSR標記引物中,N 10、N 21、N 24和N 32多態性百分率在90%以上,N 16和N 22多態性百分率為80%～90%。在本研究所的17對引物中,有效等位基因數、Nei’s遺傳多樣性指數和Shannon信息指數最高的引物N 32,最低的是引物NtSSR 2。

表3 SSR-PCR篩選獲得的引物序列Table 3 Primer sequences obtained by SSR-PCR screening

表4 17對引物擴增結果Table 4 Amplification results of 17 pairs of primers

2.2 多花水仙資源主成分分析與親緣關系分析

2.2.1多花水仙資源主成分分析

用NTsys-pc 2.10e軟件對21份多花水仙資源進行遺傳多樣性矩陣的主成分分析。由圖1可看出,供試多花水仙種質資源可被分為四類,第Ⅰ類主要是來自漳州、平潭、南日島、崇明和普陀的中國水仙;第Ⅱ類為“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”;第Ⅲ類為“白花1號”“白花2號”“崇明白”和“Ziva”水仙;第Ⅳ類為“云香”“六橫白”“Pearl”。

圖1 21份多花水仙主成分分析Fig.1 Principal component analysis of 21 resources of N. tazetta

圖2 21份多花水仙資源的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 21 resources of N. tazetta

2.2.2多花水仙資源親緣關系分析

21份水仙種質資源的遺傳相似系數在0.443 4～1.000 0之間。在遺傳相似系數為0.74處,可將多花水仙資源分為四類,第Ⅰ類有12個多花水仙資源,含“金三角”“平潭單瓣”“漳州單瓣”“南日島野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明復瓣”“漳州單瓣”“平潭野生”“崇明單瓣”“普陀復瓣”“綠狀元”“普陀單瓣”,其中除“綠狀元”(花被綠色)外,均為黃白雙色花。第Ⅱ類有2個多花水仙資源,為“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”,均為黃色花。第Ⅲ類有4個多花水仙資源,分別為“白花1號”“白花2號”“崇明白”“Ziva”,均為白色花。第Ⅳ類有3個多花水仙資源,分別為“云香”“六橫白”和“Pearl”,均為白色花被,淺黃色副冠,UPGMA聚類結果和主成分分析結果一致。

本研究表明,親緣關系最近的是“平潭單瓣”“漳州單瓣”“南日島野生”“Chinese Sacred Lily”“崇明復瓣”“漳州單瓣”“平潭野生”“崇明單瓣”“普陀復瓣”“綠狀元”和“普陀單瓣”。“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”為洋水仙,其中“Grand Soleil d′Or”和“彩色水仙”親緣關系較近,“Ziva”和“崇明白”親緣關系較近,“Pearl”和“云香”“六橫白”有較近的親緣關系。

對21份多花水仙聚類的4個類群用POPGEN 32軟件進行各項遺傳參數分析,結果(表5)表明,第Ⅲ類群的多態性百分率(33.02%)、觀測等位基因數(1.330 2)、有效等位基因數(1.226 1)、Nei’s遺傳多樣性指數(0.130 4)和Shannon信息指數(0.191 6)均最高,第Ⅳ類群最低。說明第Ⅲ類群的遺傳多樣性是4個類群中最高的, 第Ⅳ類群的遺傳多樣性最低。

表5 4個多花水仙類群的遺傳多樣性Table 5 Genetic diversity of four N. tazetta groups

3 討 論

本研究篩選得到的17對SSR標記引物可以較好地將供試水仙資源從DNA水平上區分開來,21份多花水仙種質資源的遺傳相似系數在0.443 4～1.000 0之間。中國水仙與其他多花水仙類群間的遺傳相似系數較低,遺傳多樣性較高,親緣關系較遠。通過UPGMA聚類分析可知,國內漳州、崇明、舟山、平潭等地的中國水仙單復瓣種質都聚在Ⅰ類群,表現其親緣關系較近。中國水仙表型特征相似,其中, “金三角”與“漳州單瓣”主要差異是副冠三裂,“綠狀元”與“漳州復瓣”主要差異是顏色為綠色[29-30]。 可見,“金三角”和“綠狀元”雖與其他中國水仙資源表型存在差異,但與中國水仙主栽品種均表現出很高的遺傳相似性。中國水仙所屬的Ⅰ類群與洋水仙(“Grand Soleil d′Or”“Ziva”和“Pearl”)所在的類群(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)遺傳相似系數在0.4～0.8之間,表現出較遠的親緣關系,與Liu等[31]的研究結果類似。另外在Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群中,“Grand Soleil d′Or”與“彩色水仙”親緣關系較近;“Ziva”與“崇明白”親緣關系較近;“Pearl”與 “云香”和“六橫白”表現出較近的親緣關系。不同種質水仙間親緣關系的區分和種質認證有利于優良水仙親本資源的保存和水仙種質創新利用。

袁菊紅[27]利用18對SSR引物對石蒜屬15個種和外類群中國水仙進行了SSR-PCR擴增,分析石蒜屬植物的遺傳多樣性和種間親緣關系。祁世明等[24-25]開發了29對水仙BES-SSR標記引物,并通過對SSR-PCR擴增反應體系中的相關因素進行優化,建立了適合水仙SSR標記分析的標準化體系。在前人研究基礎上,本研究以21份多花水仙為材料,基于中國水仙“玉玲瓏”轉錄組數據進一步開發的6對SSR標記引物,其條帶較清晰,非特異性條帶較少,多態性較高,通用性好。本研究新開發的引物可豐富水仙SSR標記引物數量,為水仙屬遺傳多樣性研究和種質資源鑒定方面奠定基礎。另外,本研究選用的17對引物并不能很好區分漳州、崇明、舟山、平潭等地的中國水仙單復瓣種質,仍需進一步開發特異性分子標記及其引物,有助于有效揭示中國水仙不同群體間的遺傳變異。本研究中,不同地區的中國水仙群體間遺傳多樣性水平低,結果與Lin等[31]、朱弘等[32]研究結論相似。探討國內外多花水仙的遺傳多樣性和親緣關系,可以為水仙育種和種質認證研究提供科學依據,進一步豐富、開發和利用國內外水仙種質資源,推進水仙市場的發展。