妊娠期女性牙齦卟啉單胞菌感染對不良妊娠結局的影響

龍黎南,儲莉鳴,丁曉穎,張治萍,胡逸凡,王 珣,謝震宇

(上海市浦東新區婦幼保健院1.婦產科;2.醫教科;3.院辦,上海 201206)

妊娠期婦女由于體內激素水平變化,口腔微生態菌群失衡,加之孕期生活習慣改變和疏于口腔衛生維護,易發展為妊娠期牙周病。據統計,全球范圍內妊娠期牙周病的患病率為30%～100%[1]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是一種革蘭陰性厭氧菌,是牙周病的關鍵致病菌[2]。研究表明,P.gingivalis不僅與牙周病密切相關,而且能夠黏附、侵入上皮細胞,激活細胞內信號轉導通路、誘導絨毛外滋養層細胞凋亡[3-5]或分泌毒性產物,或隨血液循環播散至全身,與不良妊娠結局(adverse pregnancy outcomes,APO)關系密切[6-8]。但目前研究主要集中于牙周病與不良妊娠結局[9-10],對于P.gingivalis的研究主要在體外細胞學和動物學實驗[3,11-12],臨床上關于妊娠期P.gingivalis的感染狀況及其與不良妊娠結局的前瞻性研究目前尚未見到?；诖?本研究通過檢測孕早期孕婦唾液中的P.gingivalis以了解孕婦P.gingivalis的感染狀況,探討妊娠期P.gingivalis感染的影響因素,并從孕早期建立隊列,通過前瞻性隊列研究分析P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響,為提高妊娠期口腔健康、制定孕期口腔保健服務策略提供科學依據,從而做到早期干預,預防不良妊娠結局的發生,改善妊娠結局。

1研究對象與方法

1.1研究對象

選取2021年12月至2022年2月在上海市浦東新區婦幼保健院初診的孕早期孕婦為研究對象。納入標準:①孕周<14周;②在本院定期產檢、分娩;③依從性好;④無認知功能障礙和精神障礙者。排除標準:①嚴重肝、腎、心等器官功能不全;②存在泌尿系統感染;③資料不全,妊娠結局失訪;④妊娠結局為自然流產者。本研究通過上海市浦東新區婦幼保健院醫學倫理學委員會批準,所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2基本資料收集

收集所有研究對象的基本信息,包括年齡、戶籍、教育程度、疾病史、不良孕產史、吸煙、孕產次、受孕方式、孕前體質指數(body mass index,BMI)、半年內牙周治療等情況。

根據國際婦產科聯盟對高齡的定義及孕產婦風險預警評估分類,將不同年齡分層為:<35歲、35～<40歲、≥40歲。疾病史:妊娠前患有糖尿病、高血壓、自身免疫性疾病其中一種,定義為既往有疾病史。不良孕產史:該孕婦既往妊娠時至少包括早產、低出生體重、死胎、死產、出生缺陷其中一種出生結局,即定義為不良孕產史。孕前BMI=孕前體重(kg)/身高(m)2,根據中國成人超重和肥胖預防控制指南(2020年),按不同BMI分層為BMI<24kg/m2、超重(24.0kg/m2≤BMI<28kg/m2)、肥胖(BMI≥28kg/m2)。吸煙:根據目前狀態分為:吸煙、曾經吸煙(現在已經戒煙≥6個月)、從未吸煙。

1.3唾液P.gingivalis 熒光定量PCR檢測

1.3.1試劑、材料

唾液采集器購自深圳華晨陽科技有限公司,唾液基因組DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,SYBR Green PCR試劑盒購自翌圣生物科技(上海)股份有限公司,P.gingivalis菌株(ATCC33277)由河南科技大學腫瘤研究所惠贈。

1.3.2孕婦唾液樣本采集、DNA提取

在采集唾液樣本前30min,孕婦用清水將口腔內雜物洗漱干凈,期間不能進食或飲用飲料,向采集漏斗中輕輕吐入唾液,直至液體唾液達2mL,將保存液緩緩倒入采集漏斗內,上下顛倒充分混勻。按照唾液基因組DNA提取試劑盒說明書提取唾液樣本DNA,-80℃下凍存。

1.3.3P.gingivalis實時PCR

根據P.gingivalis16S rDNA基因序列(GeneBank:NR_040838),使用Primer Premier 5軟件設計特異性引物,序列為:forward:5′-AATAACGGGCGATACGA-3′;reverse:5′-TGTTCCTCCGCTTGTGC-3′。PCR反應體系為20μL:SYBR Green Mix 10μL,上下游引物各0.5μL,DNA模板2μL;反應條件:95℃ 5min,95℃ 10 s,60℃ 30s,40個循環,所有反應在ABI-7300型實時PCR(real time PCR)儀上進行,利用ABI Prism 7300 SDS software軟件分析擴增結果。每次反應均設P.gingivalis陽性對照、唾液鏈球菌(S.salivarius)陰性對照及空白對照。

1.4孕期隨訪、觀察不良妊娠結局指標

根據P.gingivalis感染狀況將研究對象分為感染組、對照組。兩組間戶籍、孕次、產次、BMI、受孕方式差異均無統計學意義(P>0.05)。①隨訪孕期產檢情況:產檢次數、孕期增重、B族鏈球菌(group B Streptococcus,GBS);②觀察兩組的孕產婦合并癥、并發癥:妊娠期高血壓、子癇前期、妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)、早產、胎膜早破、胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)、低出生體重、產后出血、新生兒感染,診斷標準依據人民衛生出版社《婦產科學》第9版[13]。

1.5統計學方法

2結果

2.1基本情況

本研究共納入390例孕婦,年齡18～45歲,平均年齡(33.26±3.49)歲,其中<35歲201例(51.54%),35～<40歲148例(37.95%),≥40歲41例(10.51%);初產婦167例(42.82%)、經產婦223例(57.18%);本市戶籍105例(26.92%)、外地戶籍285例(73.08%)。

2.2孕婦唾液P.gingivalis的檢測結果

孕婦唾液P.gingivalis的實時PCR檢測結果見圖1,可見擴增曲線重復性好,溶解曲線單一峰代表引物特異性較好,以Ct<29為陽性;Ct≥29為陰性。

注:A為P.gingivalis real time PCR擴增曲線;B為P.gingivalis real time PCR溶解曲線。

2.3妊娠期P.gingivalis的感染狀況及影響因素分析

390例孕婦中,P.gingivalis陽性176例,陰性214例,妊娠期P.gingivalis感染率為45.13%。單因素分析結果顯示,孕婦年齡、文化程度、既往疾病史、不良孕產史、吸煙、胎兒數目、半年內牙周治療、陰道炎與P.gingivalis感染顯著相關(P<0.05),見表1。

表1 妊娠期P.gingivalis感染影響因素的單因素分析 [n(%)]

以妊娠期是否P.gingivalis感染為因變量,納入單因素分析中差異有統計學意義的因素為自變量,進行多因素Logistic回歸分析。結果顯示,相對于年齡<35歲,年齡35～<40歲、≥40歲孕婦P.gingivalis感染的風險均增加(OR=1.674,95%CI:1.058～2.648,P<0.05;OR=2.085,95%CI:1.026～4.238,P<0.05);吸煙的孕婦P.gingivalis感染的風險是未吸煙孕婦的2.916倍(OR=2.916,95%CI:1.051～8.094,P<0.05),但曾經吸煙對比從未吸煙的孕婦無統計學差異(P>0.05);低文化程度(高中及以下)、不良孕產史、患有陰道炎(OR=2.017,95%CI:1.310～3.105;OR=1.788,95%CI:1.017～3.144;OR=1.877,95%CI:1.217～2.896)均是妊娠期P.gingivalis感染的獨立危險因素(P<0.05)。但在控制了年齡、文化程度、吸煙等因素后,半年內有牙周治療并不是P.gingivalis感染的保護因素(P>0.05),見表2。

表2 妊娠期P.gingivalis感染影響因素的Logistic回歸分析

2.4感染組與對照組的孕期情況、分娩結局的比較

兩組間產檢次數、孕期增重、妊娠期高血壓、胎膜早破、產后出血、低出生體重、新生兒感染情況比較差異均無統計學意義(P>0.05)。但感染組GBS陽性、子癇前期、GDM、早產、FGR的發生率明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3。

表3 兩組孕期情況、分娩結局的比較

2.5妊娠期P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響

將至少出現子癇前期、GDM、早產、FGR其中一種,定義為不良妊娠結局,以是否有不良妊娠結局為因變量,納入感染組、對照組間有統計學差異的因素為自變量,納入多因素Logistic回歸分析。結果顯示,在控制了年齡、雙胎、不良孕產史、GBS陽性等因素后,P.gingivalis感染明顯增加了不良妊娠結局的發生風險(OR=2.175,95%CI:1.291～3.662),P.gingivalis感染的孕婦不良妊娠結局的發生率是未感染孕婦的1.778倍(RR=1.778,95%CI:1.223～2.432),見表4。

表4 不良妊娠結局影響因素的Logistic回歸分析

3討論

妊娠期常見的牙周致病菌有:牙齦卟啉單胞菌(P.gingivalis)、中間普氏菌(P.intermedia)、伴放線聚集桿菌(A.actinomycetemcomitans)、具核梭桿菌(F.nucleatum)等。P.gingivalis是一種革蘭陰性厭氧菌,具有菌毛、牙齦素、脂多糖等多種毒力因子,直接入侵牙周或母胎組織,造成全身和胎盤組織的免疫環境失調和氧化應激,或釋放細菌產物間接通過炎癥介質等傳播到胎兒-胎盤單位[11],導致早產、子癇前期、早產低出生體重兒等多種不良妊娠結局[6-8,14]。Amarasekara等[15]通過鑒定、比較子癇前期與正常孕婦胎盤組織中的細菌,發現P.gingivalis存在子癇前期孕婦的胎盤組織中,而正常孕婦胎盤中均未發現P.gingivalis;Vanterpool等[16]通過免疫熒光組織法在胎盤、臍帶標本中檢測P.gingivalis并定位,結果顯示臍帶P.gingivalis感染與子癇前期顯著相關,胎盤中的P.gingivalis與早產顯著相關,提示胎盤絨毛間質、臍帶P.gingivalis感染可能是不良妊娠結局的重要因素。因此,研究妊娠期女性P.gingivalis的感染狀況及對不良妊娠結局的影響,對通過改善口腔健康預防不良妊娠結局的發生具有重要的臨床意義。

3.1妊娠期P.gingivalis感染對不良妊娠結局的影響

本研究在控制了混雜因素后,結果顯示P.gingivalis感染明顯增加了子癇前期、GDM、早產、FGR不良妊娠結局的風險,可能作用機制主要包括①P.gingivalis與絨毛外滋養層細胞凋亡有關,Ren等[3]通過P.gingivalis感染人絨毛外滋養層細胞(HTR8/SVneo細胞),發現P.gingivalis誘導炎性因子IFN-γ和IL-8分泌,通過激活ERK1/2和P38信號通路,導致人絨毛外滋養層細胞凋亡;Hirohata[4]等將HTR8/SVneo細胞接種于含有P.gingivalis的培養基,發現P.gingivalis能夠抑制滋養層細胞的侵襲和隨后的血管重塑,從而影響胎盤生長及胎兒健康,導致子癇前期、FGR等多種不良妊娠結局。②P.gingivalis感染與氧化應激有關,Napa等[17]發現P.gingivalis脂多糖能誘導牙齦成纖維細胞線粒體含量增加、活動增強,產生大量過氧化氫(H2O2),H2O2等活性氧在血漿及胎盤中顯著增加,與抗氧化劑的平衡失調,在子癇前期的發生中起重要作用[18]。③P.gingivalis可能改變腸道菌群,引起糖代謝異常、胰島素抵抗,參與了GDM的發病機制,且與體內血糖水平呈正相關[19-20]。張欣等[21]探討口腔菌群、腸道菌群與GDM的關系,結果顯示P.gingivalis與口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT)血糖水平顯著正相關。

目前發現P.gingivalis感染導致不良妊娠結局的可能作用途徑主要有2種:①P.gingivalis破壞牙周組織,血行播散或直接入侵母胎組織[15-16];②P.gingivalis作為病原菌,間接通過細菌產物或炎性介質的釋放進入母體循環達到母胎界面,從而增加不良妊娠結局的發生[11]。

3.2妊娠期P.gingivalis感染的高危因素

本研究結果顯示,妊娠期P.gingivalis感染率高達45.13%,與2014年陳琳等調查的上海市孕婦牙周病患病率為49.6%相近,但楊秀巧等[22]通過調查380名妊娠期婦女顯示,妊娠期牙周病患病率為87.1%,數據差距之大的原因可能與臨床對牙周病的主觀診斷不統一或調查對象所處的妊娠周期不同有關,妊娠中晚期孕婦比早期更容易患牙周病,但本研究對象選擇了妊娠早期孕婦,原因為:①本研究目的為早干預、早治療,從而降低不良妊娠結局;②P.gingivalis感染在妊娠早期就干擾了絨毛外滋養層細胞向子宮血管侵襲,影響妊娠過程中子宮螺旋動脈重塑,導致不良妊娠結局[4-5,23]。

既往研究發現,妊娠牙周病與年齡[22]、文化程度[24-25]、吸煙[26]有關。楊秀巧等[22]將孕婦年齡按20～27歲、28～35歲和35歲以上進行年齡分組,研究表明隨著妊娠婦女年齡的增大,牙周炎癥狀況加重。本研究結果顯示,高齡、低文化程度、吸煙同樣是妊娠期P.gingivalis感染的危險因素,年齡越大,其感染風險越大,與妊娠期牙周病相同。但本研究還發現,陰道炎、既往不良孕產史均是妊娠期P.gingivalis感染的獨立危險因素,可能原因:①引起慢性牙周炎癥的細菌包括革蘭陰性桿菌和厭氧菌,與細菌性陰道病患者的細菌相似[27];②既往不良孕產史與P.gingivalis感染可能為雙向關聯的關系,一方面,P.gingivalis感染引起前次不良妊娠結局,另一方面,既往不良妊娠結局可能引起了隱匿的胰島素抵抗、炎癥等,使機體對P.gingivalis易感性增加。

3.3妊娠期P.gingivalis感染的治療

妊娠期牙周基礎治療可改善孕婦的口腔微生態,本研究顯示,半年內有牙周治療史的孕婦P.gingivalis感染率明顯降低,但在排除了其他因素后,半年內有牙周治療史并不是P.gingivalis感染的保護因素。關于孕期牙周治療能否減少不良妊娠結局的發生目前尚無定論,Liu等[28]研究發現妊娠期牙周治療明顯降低GDM的發生率;Bi等[29]系統地評估了妊娠期牙周治療對妊娠結局的影響,結果顯示妊娠期牙周治療可降低圍產期死亡率和早產的風險,并提高新生兒出生體重;但也有研究發現,妊娠期牙周基礎治療并不能降低不良妊娠結局的風險[30-31],其原因可能為:①P.gingivalis在妊娠早期就參與了不良妊娠結局的發病機制;②治療時間太晚,P.gingivalis已經感染了胎盤等組織,牙周基礎治療不能有效地抑制。因此,如何同時抑制口腔、胎盤中的P.gingivalis及選擇P.gingivalis感染的治療時機,從而預防不良妊娠結局的發生,需要進一步深入的研究。

綜上所述,妊娠期P.gingivalis的感染率高,是不良妊娠結局發生的危險因素,應關注妊娠期P.gingivalis的感染狀況及口腔衛生狀況,尤其加強高齡、低文化水平、吸煙、患有陰道炎、既往不良孕產史高危人群的口腔健康教育,從而早期干預、治療,降低不良妊娠結局的發生,提高人口出生質量。但本研究局限于單中心,地域差異無法兼顧,且納入的影響因素僅包括孕婦的基本資料,未包含平時口腔保健狀況及習慣,可能存在選擇偏倚,尚需更大樣本,擴大范圍進一步探討。