不同程度煙草白粉病感染秦?zé)?9的DNA甲基化研究

鐵丹 張保華 張軍倉(cāng) 趙繼剛

摘要 ［目的］了解煙草白粉病對(duì)秦?zé)?9 DNA甲基化水平的影響，探明其DNA甲基化在脅迫條件下對(duì)煙草的調(diào)控作用。［方法］結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)技術(shù)，對(duì)不同程度感染煙草白粉病秦?zé)?9的基因組DNA甲基化水平進(jìn)行MSAP分析。 ［結(jié)果］DNA甲基化在白粉病脅迫條件下調(diào)控?zé)煵萆L(zhǎng)，秦?zé)?9感染白粉病程度越高，其DNA甲基化水平越高。［結(jié)論］該試驗(yàn)通過(guò)研究感染不同程度煙草白粉病的秦?zé)?9間的表觀遺傳多樣性，為探明秦?zé)?9生態(tài)適應(yīng)性獲得的表觀遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。該試驗(yàn)結(jié)果豐富了煙草基因組甲基化方面的研究?jī)?nèi)容，為今后研究煙草表觀遺傳學(xué)提供一定的參考。

關(guān)鍵詞 煙草白粉病；秦?zé)?9；DNA甲基化；MSAP；表觀遺傳

中圖分類號(hào) S435.72? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2023）13-0135-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.032

Study on DNA Methylation of Qinyan 99 Infected with Tobacco Powdery Mildew in Different Degrees

TIE? Dan， ZHANG? Bao-hua， ZHANG? Jun-cang? et al

（Baoji Tobacco Company Linyou Branch，Baoji， Shaanxi?? 721599）

Abstract ［Objective］ To understand the influence of Erysiphe cichoracearum DC. on DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings and explore the regulation of DNA methylation on Nicotiana tabacum under stress. ［Method］ The genomic DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings with different infection degrees of Erysiphe cichoracearum DC. was analyzed MSAP by using polyacrylamide gel electrophoresis technique. ［Result］ The higher the degree of Erysiphe cichoracearum DC. infection， the higher the DNA methylation level of Qinyan 99 seedlings. ［Conclusion］ In this study， the epigenetic diversity of Qinyan 99 infected with different degrees of tobacco powder virus was studied to provide a theoretical basis for exploring the epigenetic mechanism of Qinyan 99s ecological adaptation. The results of this experiment enrich the research content of Nicotiana tabacum genome methylation， and provide a certain reference for the future study of Nicotiana tabacum epigenetics.

Key words Erysiphe cichoracearum DC.;Qinyan 99;DNA methylation;MSAP;Epigenetics

作者簡(jiǎn)介 鐵丹（1996—），女，陜西寶雞人，助理農(nóng)藝師，碩士，從事逆境脅迫條件下的植物響應(yīng)研究。

收稿日期 2022-08-22

煙草作為我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。但由于病蟲害的發(fā)生，每年都會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。所以，在煙草種植過(guò)程中各類病蟲害的防治也成為當(dāng)前研究工作重點(diǎn)。煙草白粉病的病原菌為二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.），屬于子囊菌亞門核菌綱白粉菌目白粉菌科白粉菌屬（Golovinomyces orontii），其作為煙草的主要病害之一，給我國(guó)的煙草生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。氣象條件可以直接影響白粉病菌的侵染時(shí)間與分生孢子的繁殖數(shù)量，也可以顯著影響白粉病的越夏、越冬、流行速度及嚴(yán)重程度［2-3］。白粉病會(huì)隨著溫度和濕度的增加，其發(fā)病速度也會(huì)增加，尤其是田間濕度過(guò)大和高溫高濕交替出現(xiàn)情況下，病害會(huì)持續(xù)加重；此外，煙草徒長(zhǎng)、種植密度過(guò)大導(dǎo)致的通風(fēng)透光不良，也會(huì)造成白粉病發(fā)病嚴(yán)重。白粉病菌只存活于活體寄主，為專性寄生菌，一般侵染植物分為分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、吸器產(chǎn)生、菌絲形成、生長(zhǎng)和分生孢子形成［4］，其病原菌主要危害植株的葉片，嚴(yán)重時(shí)危害果實(shí)。植株在發(fā)病初期，葉片表面通常會(huì)出現(xiàn)褪綠斑點(diǎn)，形成白粉狀病斑，隨后連成一片，成為邊緣不明顯的白色粉狀物，可降低植株的光合能力，嚴(yán)重時(shí)造成整株死亡［5-6］，從而影響煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究表明，表觀遺傳調(diào)控機(jī)制（DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑和小分子RNAs（sRNAs））可影響植物表型可塑性［7］。在植物中由小分子RNA所介導(dǎo)的DNA甲基化模式最早在感染類病毒的煙草中發(fā)現(xiàn)［8］。DNA甲基化是植物生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)建成、逆境脅迫等過(guò)程中一種常見的表觀遺傳現(xiàn)象，也是植物逆境響應(yīng)的重要機(jī)制，其通過(guò)調(diào)控植物開花、產(chǎn)量、抗性等與物種穩(wěn)定性或品種一致性密切相關(guān)的性狀來(lái)維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育［9-10］。DNA甲基化主要是高等真核生物中胞嘧啶殘基的甲基化［11］，是植物中表觀遺傳效應(yīng)研究最多的內(nèi)容，也是最早發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳途徑之一。在植物中，胞嘧啶甲基化在以下3種不同的序列中發(fā)現(xiàn)：對(duì)稱的CG和CHG位點(diǎn)（H = A，C，T）和不對(duì)稱的CHH位點(diǎn)。這3種情況下的甲基化會(huì)在轉(zhuǎn)座元件和重復(fù)序列中發(fā)生，它們通常與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)［12］。但不同植物品種，即使是同一品種的不同發(fā)育時(shí)期和不同器官中的甲基化水平也有所不同［13］。研究表明，相同種屬煙草的不同品種間甲基化修飾水平不同，其DNA甲基化水平在29.72%～43.37%［14］。Boyko等［15］研究發(fā)現(xiàn)，煙草感染普通花葉病毒后其基因組甲基化水平提高，但降低了與抗病相關(guān)的區(qū)域甲基化水平；生物脅迫可以誘導(dǎo)植物基因組DNA甲基化水平變化，改變基因的表達(dá)水平，從而逃避或耐受生物脅迫。Dowen 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，DNA胞嘧啶甲基化在病原菌-寄主互作中，可調(diào)控寄主基因表達(dá)的方式防御病原菌，從而在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及響應(yīng)生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用；DNA甲基化可能參與了病原菌-寄主互作的抗病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［17］及基因表達(dá)水平變化與DNA甲基化程度密切相關(guān)［18］。因此，筆者通過(guò)植物甲基化MSAP技術(shù)，研究煙草白粉病毒不同感染程度的秦?zé)?9間的表觀遺傳多樣性，為探明秦?zé)?9生態(tài)適應(yīng)性獲得的表觀遺傳機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

“秦?zé)?9” 為茄科煙草屬煙草（Nicotiana tabacum）草本植物。依據(jù)白建保（2010年）煙草白粉病病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采集樣品，于 2021年7月20日從陜西省寶雞市麟游縣九成宮鎮(zhèn)豐塬村大田采集4種不同感染程度（0、3、7及9級(jí)）的秦?zé)?9葉片。采集處于同一天移栽的同一片煙田內(nèi)不同發(fā)病程度的秦?zé)?9葉片，采集的個(gè)體間聚力不低于50 cm；每種程度至少采集3株作為重復(fù)處理。隨后，為盡量減少葉表面的污染，將用75%的乙醇輕輕地擦洗所采集的煙草葉片，裝在茶包袋中，再置于裝有硅膠的塑封袋中干燥，用于后續(xù)植物DNA提取。

0級(jí)，無(wú)病斑；

1級(jí)，病斑面積占葉片面積的5%以下；

3級(jí)，病斑面積占葉片面積的6%～10%；

5級(jí)，病斑面積占葉片面積的11%～20%；

7級(jí)，病斑面積占葉片面積的21%～40%；

9級(jí)，病斑面積占葉片面積的41%以上。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物基因組的提取。

用植物DNA提取試劑盒（BioTeke，北京）提取秦?zé)?9葉片DNA，所提取的DNA放置在-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因組DNA濃度和純度檢測(cè)。

用核酸測(cè)定儀（BioSpec-nano）分別于260和280 nm處分別測(cè)定吸光度值以檢測(cè)DNA的濃度，一般情況認(rèn)為OD260/OD280的值在1.7～1.9純度均較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，隨后用ddH2O將DNA濃度均稀釋為100 ng/μL。

1.2.3 MSAP（甲基化敏感多態(tài)性）分析。

1.2.3.1 基因組DNA雙酶切。

采用核酸內(nèi)切酶Eco RI（識(shí)別六堿基）分別與同裂酶Msp I（識(shí)別四堿基）和Hpa II組合對(duì)植物樣本DNA進(jìn)行雙酶切。酶切體系總體積為20 μL，包括5 μL cDNA、2 μL Cutsmart TM Buffer、1 μL Eco RI、1 μL Hpa II/Msp I、用ddH2O補(bǔ)足至20 μL，將混合物混勻于37 ℃酶切5 h。為使酶徹底失活，Eco RI+Msp I酶切體系于65 ℃滅活20 min；Eco RI+Hpa II于80 ℃ 滅活20 min，酶切產(chǎn)物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.2 酶連接反應(yīng)。

人工設(shè)計(jì)的與Eco RI+Hpa II/Msp I酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的人工接頭加于酶切片段兩端（表1）。接頭使用前需在100 ℃的條件下變性5 min。酶連體系總體積為30 μL，包括5.0 μL 酶切產(chǎn)物、3.0 μL 10×T4 DNA Buffer、0.5 μL T4 DNA ligase、1.0 μL Eco RI adaptor、1.0 μL Hpa II/Msp I adaptor、用ddH2O補(bǔ)足至30 μL，將混合物混勻于16 ℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物冰箱4 ℃保存。

1.2.3.3 預(yù)擴(kuò)增。

預(yù)擴(kuò)增體系總體積為30.0 μL，包括3.0 μL 連接產(chǎn)物、0.5 μL Eco RI pre-selective primer、0.5 μL Hpa II/Msp I pre-selective primer、17.5 μL? 2 × Taq PCR master mix，用ddH2O補(bǔ)足至30 μL。PCR預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)程序：72 ℃ 2 min →94 ℃ 2 min →94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（25個(gè)循環(huán)）→ 72 ℃ 10 min。預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 選擇性擴(kuò)增。

選擇性擴(kuò)增體系總體積為50 μL，包括1 μL 稀釋30×預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物、1 μL Eco RI selective primer、1 μL Hpa II/Msp I selective primer、25 μL 2 × Taq PCR master mix，用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。降式PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min → 94 ℃ 30 s → 65 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min（15個(gè)循環(huán)，退火溫度每個(gè)循環(huán)降1 ℃）→ 94 ℃ 30 s → 56 ℃ 30 s → 72 ℃ 1 min → 72 ℃ 10 min；將產(chǎn)物于70 ℃滅活10分鐘，4 ℃保存即可。

1.2.3.5 聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)（PAGE）。

配制5%聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分離：于大燒杯中加入33.3 mL Acr和20 mL 5×TBE Buffer，混合用玻璃棒攪拌均勻后，加入700 μL 10%的APS和65 μL TEMED溶液作為助凝劑，隨后用ddH2O補(bǔ)足至100 mL，迅速混勻后立即用10 mL移液槍向玻璃板內(nèi)灌膠［19］。制作好的凝膠板組裝放入含有1×TBE的電泳槽中，預(yù)電泳1 h使膠面溫度達(dá)到55 ℃時(shí)上樣，260 V下電泳3.5 h。電泳結(jié)束后，剝離2塊玻璃板，將長(zhǎng)玻璃板上的電泳條帶進(jìn)行固定、銀染和顯色，ddH2O沖洗干凈后，用凝膠成像系統(tǒng)（GBoxF3，GeneCompany Limited，UK）拍膠保存，并進(jìn)行條帶計(jì)數(shù)和分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013（Microsoft、WA、USA）統(tǒng)計(jì)MSAP凝膠電泳圖上100～500 bp條帶，記錄條帶的有（1）和無(wú)（0）情況。DNA甲基化的限制性內(nèi)切位點(diǎn)（5′SCCGG）有3種不同的類型：①Eco RI-Hpa II和Eco RI-Msp I酶切片段都存在（1/1）表示未發(fā)生甲基化狀態(tài)；②Eco RI-Hpa II（1/0）或 Eco RI-Msp I（0/1）片段只存在1種，表示發(fā)生甲基化狀態(tài)（半甲基化或者雙鏈內(nèi)部甲基化）；③Eco RI-Hpa II and Eco RI-Msp I片段（0/0）被認(rèn)為是可能由片段缺失或超甲基化造成的無(wú)信息位點(diǎn)［20］。在msap包中計(jì)算未甲基化、半甲基化、完全甲基化或不存在靶標(biāo)的百分比，用半甲基化及全甲基化的總和衡量總甲基化水平［21］。對(duì)統(tǒng)計(jì)形成的0/1矩陣?yán)肦軟件（RStudio，New Zealand）的msap軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；隨后，用分子方差分析（AMOVA）檢查整體分化和兩兩間的差異，用pegas包進(jìn)行AMOVA分析，將Phi-st作為固定指數(shù)（分子數(shù)據(jù)中Fst的類似物）［22］；用ade4包進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）［23］。

總擴(kuò)增條帶數(shù)＝Type I+Type II+Type III+Type IV

總甲基化條帶數(shù)＝Type II+Type III

未甲基化率＝Type I條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

半甲基化率＝Type II條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

全甲基化率＝Type III條帶數(shù)/總甲基化條帶數(shù)×100％

MSAP＝（Type II+Type III條帶數(shù)）/總甲基化條帶數(shù)×100％

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

由于MSAP技術(shù)對(duì)基因組DNA質(zhì)量要求很高，模板DNA的純度直接影響后續(xù)酶切、擴(kuò)增以及MSAP譜帶的穩(wěn)定性，為滿足MSAP試驗(yàn)要求，用核酸測(cè)定儀（BioSpec-nano）分別于260和280 nm處分別測(cè)定吸光度值以檢測(cè)DNA的濃度，一般情況認(rèn)為OD260/OD280在1.7～1.9純度較好。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示樣本所提取的秦?zé)?9葉片基因組DNA主帶清晰，無(wú)降解、無(wú)雜質(zhì)現(xiàn)象，符合試驗(yàn)對(duì)DNA的要求。隨后用ddH2O將DNA濃度均稀釋為100? ng/μL可用于后續(xù)甲基化MSAP檢測(cè)（圖1）。

2.2 預(yù)擴(kuò)增結(jié)果

用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物均勻彌散，且連續(xù)成片，有部分有條帶（圖2），符合MSAP選擴(kuò)模板的要求。

2.3 MSAP試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)聚丙烯酰胺凝膠條帶，選擇較為清晰的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”。依據(jù)Schulz等［20］的相關(guān)研究將2種酶組合所產(chǎn)生的條帶類型分為4種情況：類型I，H和M均有條帶，記為（1，1），表示未發(fā)生甲基化；類型II，H有條帶，而M無(wú)條帶，記為（1，0），表示發(fā)生半甲基化；類型 Ⅲ，H無(wú)條帶，而M有條帶，記為（0，1），表示發(fā)生全甲基化；類型 Ⅳ，H和M均無(wú)條帶，記為（0，0），該類情況較為復(fù)雜，Schulz等［20］認(rèn)為很可能是基因突變的結(jié)果，所以一般作為無(wú)信息處理。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果見圖3。

2.4 白粉病對(duì)DNA甲基化水平的影響

由表2可知，與CK（對(duì)照組）相比，不論煙草白粉病發(fā)病程度高低，其總甲基化水平程度均上升，Ⅶ級(jí)發(fā)病程度誘導(dǎo)了最低的未甲基化和半甲基化水平，并隨著發(fā)病程度的增加，其DNA甲基化水平上升的程度越高，其總甲基化水平依次為Ⅲ級(jí)為24.31%，Ⅶ級(jí)為27.24%，Ⅸ級(jí)為29.61%。因此，不同程度的白粉病感染情況會(huì)影響煙草的DNA甲基化水平，其發(fā)病程度越高，總甲基化程度越高。

由表3可知，對(duì)照組（CK）的煙草與其他不同發(fā)病程度的煙草成對(duì)比較P值分別為0.048、0.029和0.027（P值均小于0.05），表明是有差異的。因此，煙草白粉病對(duì)秦?zé)?9的DNA甲基化水平有顯著影響（P<0.05），且這種差異受到白粉病不同發(fā)病程度的影響。

秦?zé)?9 DNA甲基化的PCoA分析圖顯示處理組之間存在顯著差異（Phi-ST=0.335 6，P<0.000 1）。2個(gè)主坐標(biāo)軸分別解釋了甲基化差異的 12.0%和22.3%。Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ 均與CK組無(wú)重疊區(qū)域，但CK和 Ⅲ 距離較近，Ⅶ 和Ⅸ 距離較近（圖4）。

3 結(jié)論與討論

研究表明，DNA甲基化修飾會(huì)導(dǎo)致植物的某些重要性狀發(fā)生變化。如不同的生態(tài)條件會(huì)影響煙草基因組的表達(dá)，K326烤煙在不同生態(tài)區(qū)的甲基化水平不同［24］。該研究中，不同程度的白粉病感染秦?zé)?9葉片會(huì)改變其DNA甲基化水平，并隨著感染程度的增加，DNA甲基化水平升高的程度越大。目前，關(guān)于DNA甲基化參與植物抗病的研究，主要集中于病原菌對(duì)植物基因組甲基化水平的影響，導(dǎo)致基因的表達(dá)水平發(fā)生變化，從而引起植物響應(yīng)的生理生化變化，參與植物的抗病反應(yīng)［25］。如Pst侵染擬南芥后，會(huì)降低CpG和CHH甲基化水平，但提高防御相關(guān)基因的表達(dá)水平［16］。DNA甲基化是在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，甲基化程度的高低直接影響了基因表達(dá)的活性。甲基化程度低，基因表達(dá)活躍；甲基化程度高，基因低表達(dá)或不表達(dá)。甲基化水平調(diào)控基因表達(dá)，基因表達(dá)時(shí)，其表現(xiàn)為低的甲基化水平；當(dāng)在植物某階段不需該基因表達(dá)時(shí)，基因的啟動(dòng)子或編碼區(qū)會(huì)重新發(fā)生甲基化，抑制基因的轉(zhuǎn)錄并終止其表達(dá)［26］。因此，秦?zé)?9感染煙草白粉病后，DNA甲基化通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)來(lái)滿足植物不同生長(zhǎng)階段的需求，這對(duì)煙草的正常生長(zhǎng)及適應(yīng)復(fù)雜多變的外界環(huán)境提供了良好的調(diào)控機(jī)制。

該研究表明DNA甲基化介導(dǎo)不同煙草白粉病感染秦?zé)?9的生長(zhǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境正常生長(zhǎng)，但仍存在不足，如該調(diào)控基因的表達(dá)方式是依賴目標(biāo)基因的甲基化還是對(duì)目標(biāo)基因起調(diào)控作用的其他基因的甲基化仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

［1］ 宋雙.陜西省煙草白粉病生理小種鑒定及其防治研究［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

［2］ 劉佳玲.煙草白粉病流行因素及防治對(duì)策［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，26（5）：38-40.

［3］ 鄭秋紅，楊霏云，朱玉潔.小麥白粉病發(fā)生氣象條件和氣象預(yù)報(bào)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)氣象，2013，34（3）：358-365.

［4］ 馬鴻艷.甜瓜白粉病抗性遺傳分析及相關(guān)基因SSR標(biāo)記［D］.哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

［5］ 王建設(shè)，陳杭.甜瓜抗白粉病鑒定［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2000，15（1）：125-128.

［6］ 蘇瑞.新疆部分地區(qū)瓜類白粉病生理小種鑒定及籽用西瓜抗性遺傳分析［D］.烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

［7］ IWASAKI M，PASZKOWSKI J.Epigenetic memory in plants［J］.EMBO journal，2014，33（18）：1987-1998.

［8］ WASSENEGGER M，HEIMES S，RIEDEL L，et al.RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants［J］.Cell，1994，76（3）：567-576.

［9］ ZHANG X Y，YAZAKI J，SUNDARESAN A，et al.Genome-wide high-resolution mapping and functional analysis of DNA methylation in Arabidopsis［J］.Cell，2006，126（6）：1189-1201.

［10］ 彭海，席婷，張靜，等.脅迫條件下植物DNA甲基化的穩(wěn)定性［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（12）：2431-2438.

［11］ FENG S H，JACOBSEN S E，REIK W.Epigenetic reprogramming in plant and animal development［J］.Science，2010，330（6004）：622-627.

［12］ SAZE H，TSUGANE K，KANNO T，et al.DNA methylation in plants：Relationship to small RNAs and histone modifications，and functions in transposon inactivation ［J］.Plant and cell physiology，2012，53（5）：766-784.

［13］ XING M Q，ZHANG Y J，ZHOU S R，et al.Global analysis reveals the crucial roles of DNA methylation during rice seed development［J］.Plant physiology，2015，168：1417-1432.

［14］ 焦俊娜.煙草甲基化模式的MSAP分析和甲基化相關(guān)基因的克?。跠］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［15］ BOYKO A，KATHIRIA P，ZEMP F J，et al.Transgenerational changes in the genome stability and methylation in pathogen-infected plants：（Virus-induced plant genome instability）［J］.Nucleic acids research，2007，35（5）：1714-1725.

［16］ DOWEN R H，PELIZZOLA M，SCHMITZ R J，et al.Widespread dynamic DNA methylation in response to biotic stress［J］.Proceedings of the national academy of sciences of the United of America，2012，109（32）：E2183- E2191.

［17］ SHA A H，LIN X H，HUANG J B，et al.Analysis of DNA methylation related to rice adult plant resistance to bacterial blight based on methylation-sensitive AFLP（MSAP）analysis［J］.Molecular genetics and genomics，2005，273（6）：484-490.

［18］ 閆偉浩.白粉病菌對(duì)甜瓜幼苗葉片DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組的影響［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

［19］ 陳瑞娟，何蕾，孫梨宗，等.銅脅迫對(duì)擬南芥幼苗生長(zhǎng)和基因組DNA甲基化的影響［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2015，34（9）：2650-2657.

［20］ SCHULZ B，ECKSTEIN R L，DURKA W.Scoring and analysis of methylation-sensitive amplification polymorphisms for epigenetic population studies［J］.Molecular ecology resources，2013，13（4）：642-653.

［21］ XU J H，TANINO K K，ROBINSON S J.Stable epigenetic variants selected from an induced hypomethylated Fragaria vesca population［J］.Frontiers in plant science，2016，7：1-14.

［22］ EXCOFFIER L，SMOUSE P E，QUATTRO J M.Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes：Application to human mitochondrial DNA restriction data［J］.Genetics，1992，131（2）：479-491.

［23］ PREZ-FIGUEROA A.msap：A tool for the statistical analysis of methylation-sensitive amplified polymorphism data［J］.Molecular ecology resouece，2013，13（3）：522-527.

［24］ 李輝，孫煥良，李德芳.不同生態(tài)區(qū)同一基因型烤煙表觀遺傳的MSAP分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，28（1）：32-36.

［25］ YU A，LEPRE G，JAY F，et al.Dynamics and biological relevance of DNA demethylation in Arabidopsis antibacterial defense［J］.Proceedings of the national academy of sciences of the United of America，2013，110（6）：2389-2394.

［26］ 李娜，張旸，解莉楠，等.植物DNA甲基化研究進(jìn)展［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2012，48（11）：1027-1036.