黨參莖基腐病病原鑒定及其防治藥劑的篩選

馮明橋 馮育才 勾偉 雷嬌嬌 韓繼懷 江龍 王尤 汪珊

摘要 ［目的］ 明確貴州省道真縣黨參莖基腐病的病原及其防治藥劑。［方法］ 利用組織分離法和柯赫氏法則進行病原菌的分離和致病性驗證，利用形態學與 rDNA－ITS 對致病菌進行鑒定，之后通過大田防治試驗測定5種殺菌劑對黨參莖基腐病的防治效果。［結果］ 引起道真黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）；殺菌劑大田防治試驗結果表明，50%多菌靈可濕性粉劑對病害的防治效果最佳，病害防治效果為81.63%；25%甲霜靈可濕性粉劑的防治效果次之，防治效果為74.49%；40%乙膦鋁可濕性粉劑、65%代森鋅可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對黨參莖基腐病的防治效果較差為30.61%～51.02%。 ［結論］道真大沙河黨參莖基腐病的病原為尖孢鐮刀菌，50%多菌靈可濕性粉劑對黨參莖基腐病的防治效果較好。

關鍵詞 黨參；莖基腐病；鐮刀菌；病原菌鑒定；防治藥劑

中圖分類號 S435.672? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0132-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.031

Identification of the Pathogen of Codonopsis pilosula Stem Base Rot and Screening of Its Control Agents

FENG Ming-qiao，FENG? Yu-cai，GOU? Wei? et al

（Guizhou Dashahe Provincial Nature Reserve Administration Bureau， Daozhen，Guizhou?? 563500）

Key words ［Objective］ To identify the pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen County， Guizhou Province and its control agents. ［Method］ The pathogenic bacteria were isolated and verified by tissue isolation method and Koch's rule. The pathogenic bacteria were identified by morphology and rDNA ITS， and then the control effect of five fungicides on stem base rot of Codonopsis pilosula was determined by field control test. ［Result］ Fusarium oxysporum was the pathogen causing the stem base rot of Codonopsis pilosula.The field control experiment of fungicide showed that 50% carbendazim wettable powder had the best effect on disease control， and the disease control effect was 81.63%;the control effect of 25% metalaxyl wettable powder was the second， and the disease control effect was 74.49%;40% ethyl phosphine aluminum wettable powder， 65% Daisen zinc wettable powder and 70% thiophanate methyl wettable powder had a poor effect on the stem base rot of Codonopsis pilosula， which was 30.61%-51.02%. ［Conclusion］ The pathogen of stem base rot of Codonopsis pilosula in Daozhen Dasha River was F. oxysporum， and 50% carbendazim wettable powder had good control effect on stem base rot of Codonopsis pilosula.

Key words Codonopsis pilosula;Stem base rot;Fusarium oxysporum;Pathogen identification;Control agents

基金項目 貴州省林業廳2017年林業優秀青年人才培養專項“洛黨參病蟲害調查及主要病蟲害綠色防控技術研究”（黔林科合J〔2017〕15號）。

作者簡介 馮明橋（1987—），男，貴州正安人，工程師，從事自然保護區管理及科學研究。通信作者，高級工程師，從事自然保護區科學研究。

收稿日期 2022-08-08

黨參（Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.）為桔梗科黨參屬多年生草本植物，其根性平、味甘，具有補中益氣、健脾益肺之功效［1］，還具有免疫調節、改善胃潰瘍、抗炎、抗氧化、調節糖脂代謝及抗腫瘤等藥理作用［2］。研究表明，黨參富含生物堿、聚炔類、木質素類、黃酮類化合物和多糖等活性成分［3］。隨著市場需求加大，貴州黨參的種植面積不斷增加，病害問題日益加重。劉春葉等［4］在貴州道真縣洛黨參主要病害發生動態中發現了白粉病（Sphaerotheca codonopisi）、根腐病（Fusarium oxysporiums）和銹病（Puccinia campanumoeae）。2021年，首次在道真的黨參上發現莖基腐病，為害面積

呈逐年上升趨勢，據調查，一般田間發病率為5%～10%，嚴重的達30%以上，該病害已成為制約當地黨參發展的主要因素之一，嚴重影響了黨參的產量與品質，給種植戶帶來巨大的經濟損失［5］。筆者從形態學以及分子生物學對黨參莖基腐病病原菌進行分離與鑒定、致病性的檢測及防治藥劑的簡單篩選，為進一步了解道真的黨參莖基腐病病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試黨參來自貴州省道真縣陽溪鎮陽壩村黨參種植基地1年生苗。防治試驗所用藥劑見表1。

1.2 試驗地概況

田間試驗在貴州省道真縣陽溪鎮陽壩村（107°38′2″～107°38′41″E、29°8′18″～29°8′56″N）進行，平均海拔1 550.2 m，月平均氣溫0.6～22.6 ℃，空氣濕度11.2%～77.1%，pH 5.4～6.9。

1.3 病樣采集與病原菌分離和純化

2022年4月在貴州省道真大沙河自然保護區黨參生產基地采集發病植株，裝入塑封袋帶回實驗室。采用常規組織分離法，剪取莖基部病健交界處1 mm×1mm 組織塊在 75%乙醇中浸泡 5 s，然后轉移至1.5%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，無菌水漂洗3次晾干，置于 PDA 培養基平板內于 25 ℃培養 5～7 d。從菌落邊緣切取菌絲塊置于PDA 培養基，在25 ℃培養7～10 d。將分離純化的菌株轉接至PDA斜面4 ℃保存備用。

1.4 致病性測定

利用無菌昆蟲針挑取PDA培養的疑似致病菌的菌絲，穿刺黨參幼苗莖部，后用無菌土掩埋莖基部。每個菌株接種處理30株黨參苗，以無菌昆蟲針穿刺黨參幼苗莖部作為對照。以上接種處理30 d后，觀察并記錄黨參發病情況，統計發病率和病情指數。病情指數根據分級標準進行測定：0級，莖基部沒有病斑；1級，莖基部有輕微病斑，病斑面積占 5%；3級，莖基部有病斑，病斑面積占10%；5級，莖基部有嚴重病斑，病斑面積占25%；7級，莖基部有嚴重病斑，病斑面積占50%以上［6］。病害發生率和病情指數的計算公式：

病害發生率=發病株數調查總株數×100%

病情指數=（各級發病數×相對應病級）調查總株數×5×100

1.5 黨參莖基腐病病原菌的鑒定

參考Weir等［7］方法進行病原菌的形態學鑒定，主要對病原菌菌落特征、顏色、菌絲及孢子大小等進行觀察。參考李婕等［8-9］的方法利用rDNA -ITS分子測序對病原菌進行測序，具體方法：首先利用CTAB法提取病原菌總DNA，利用真菌通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和 ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）進行序列擴增，PCR擴增體系和反應程序與漆永紅等［6］的方法一致。得到序列后通過NCBI的Blast 進行序列的比對分析，同時利用 MEGA 7.0進行包含致病菌 ITS 序列在內的系統進化樹，綜合形態學與分子生物學的方法進行病原菌的鑒定。

1.6 田間防治試驗

設計5個處理，即表1中的5種藥劑，清水處理作為對照。每個處理的小區面積為2 m×10 m，每個處理3個重復。于2022年5月試驗地有莖基腐病發生時開始藥劑噴施，從第1次噴施開始，每隔10 d噴藥1次，連續噴藥3次。每種藥劑的用量為1 500 g/hm2。在最后一次噴藥10 d后統計黨參莖基腐病的病害發生率和病情指數進而計算防治效果。防治效果計算公式：

防治效果=對照病情指數-處理對照指數對照病情指數×100%

2 結果與分析

2.1 黨參莖基腐病致病菌分離及致病性檢測

道真黨參莖基腐病田間發病癥狀見圖1A。黨參莖基腐病發生初期，在莖的基部產生白色的小菌落，腐爛狀，向上延伸至葉片周圍，葉片感病以后變薄變透明的同時逐漸腐爛，其間葉子漸變成黃綠色。后期莖基和葉片成水漬狀癱軟匍匐在地上，直至整個植株稀爛于地上。采用組織分離法由黨參莖基部分離獲得真菌20余菌株，通過形態學檢測發現其中15種屬于鐮刀菌屬（Fusarium spp.）真菌。選取15個鐮刀菌屬真菌中的5個菌株（DS-1、DS-2、DS-3、DS-4、DS-5）進行黨參大田的回接試驗，發現5個菌株均可引起黨參莖基腐病（圖1B）。5個菌株引起黨參莖基腐病的病害發生率為85%～92%，病情指數為76～88。其中，菌株DS-4的發病率和病情指數最高分別為92%和88。

2.2 黨參莖基腐病病原菌的形態學特征

對回接試驗引起發病的5個菌株進行形態學觀察，發現其在PDA培養基上的顏色、質地相同，菌絲和孢子一致。在PDA培養基上菌落白色、粉色至紫色。大型分生孢子鐮孢形，中間粗，兩端尖細，具3～5個橫隔膜，多為3個隔，大小為（23.5～32.9）μm×（2.4～3.5）μm，足胞明顯。小型分生孢子橢圓形、長橢圓形，單胞，無色，假頭狀，大小為（3.5～14.1）μm×（1.8～2.9）μm。根據形態特征，查閱真菌鑒定手冊，5個引起黨參莖基腐病菌株的形態學特征與尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）一致（圖2）。

2.3 病原菌分子生物學鑒定結果

隨機選取5個致病菌株的1個進行DNA的提取和rDNA-ITS序列的擴增。結果獲得長度為541 bp 的序列。 NCBI 的 Blast 比對結果顯示，該序列與 GenBank 登錄號為MW760815的F.oxysporum的序列覆蓋度為 100%，序列相似性為 100% 。由圖3可知，致病菌株的ITS序列與尖孢鐮刀菌聚為一類，親緣關系較近。由此結合形態學與分子生物學鑒定黨參莖基腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌。菌株DS-4的GenBank號為OP164704。

2.4 不同殺菌劑對黨參莖基腐病的田間防治效果

由表2可知，清水處理下黨參莖基腐病的發生率達95%，且病情指數較高達98。5種藥劑處理下，黨參莖基腐病的病害發生率和病情指數均有所下降。其中，多菌靈600倍液處理下的病害發生率最低為28%，病情指數為18，防治效果達81.63%；其次是甲霜靈500倍液處理下的病害發生率為35%，病情指數為25，防治效果達74.49%。而另外3種藥劑處理，黨參莖基腐病的病害發生率均高于56%，防治效果36.73%～51.02%。

3 結論與討論

貴州道真地區春季濕熱多雨，黨參4—5月處于幼苗時期，易受病害的侵染，而對病害的有效防治必須要準確掌握引起病害的病原菌［10］，故該研究對貴州道真黨參的莖基腐病致病菌進行分離純化、致病性檢測，并通過形態學和分子生物學技術進行分析，確定引起黨參莖基腐病的主要致病菌為尖孢鐮刀菌。尖孢鐮刀菌是農業生產中土傳病害的重要病原菌之一，具有很強的寄生和腐生能力，目前已報道的黨參病害中，尖孢鐮刀菌是根腐病病原菌的優勢菌種［11-13］。該試驗中，選取5種常用化學藥劑對黨參莖基腐病進行簡單的防治，結果表明，多菌靈對黨參莖基腐病的防治效果較好，為黨參莖基腐病的田間防治提供理論依據。但需要注意的是，該研究的防治試驗是在發病初期開始連續噴施，進而取得了更好的防治效果。不同地區應根據病害發生規律，在早期予以施藥。此外，需要注意在病害防治過程中，長期且單一地使用同一種化學藥劑進行病害防治，病原菌可能會對其產生抗性，防治效果會逐漸減弱，故在實際生產中，應多種藥劑交替使用，且發現病株以后，應及時對病害侵染地進行消殺工作，防止其進一步擴大。

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