軍配盲蝽的分子鑒定及其生物學(xué)特性

孫榮華 羅卿權(quán) 孫雪婷 路廣亮 季國輝 朱燁 王鳳

摘要 擴(kuò)增了軍配盲蝽的線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶（cytochrome oxidase c subunit I，COI）基因片段并測序，將測序結(jié)果與 GenBank中的序列進(jìn)行比對，與數(shù)據(jù)庫中的軍配盲蝽Stethoconus japonicus的COI（KY367030.1，KY367031.1）序列的相似性達(dá)100%，進(jìn)一步復(fù)核該天敵的傳統(tǒng)形態(tài)鑒定結(jié)果。用 MEGA-X軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確了軍配盲蝽的分類地位。此外，觀察了軍配盲蝽的捕食行為等生物學(xué)特性。

關(guān)鍵詞 軍配盲蝽；分子鑒定；生物學(xué)特性

中圖分類號 S476.2? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2023）13-0089-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.13.021

Molecular Identification and Biological Characteristics of Stethoconus japonicus

SUN Rong-hua， LUO Qing-quan， SUN Xue-ting et al

（Shanghai Academy of Landscape Science and Planning， Shanghai 200232）

Abstract In this paper， the mitochondrial DNA Cytochrome oxidase C subunit I （COI） gene fragment of Stethoconus japonicus was amplified and sequenced. The sequencing results were compared with the sequences in GenBank. The sequence similarity with COI （KY367030.1， KY367031.1） of Stethoconus japonicus in the database was 100%. The traditional morphological identification results of this natural enemy were further reviewed. The phylogenetic tree was constructed by adjacency method using MEGA-X software， and the taxonomic status of Stethoconus japonicus was clarified. In addition， the predation behavior and other biological characteristics of Stethoconus japonicus were observed.

Key words Stethoconus japonicus;Molecular identification;Biological characteristics

基金項目 上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金項目（PKC2020-C002）。

作者簡介 孫榮華（1990—），女，山東聊城人，工程師，碩士，從事綠化林業(yè)植物保護(hù)研究。

通信作者，高級工程師，碩士，從事城市綠地病蟲害防控應(yīng)用技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

收稿日期 2022-08-23

懸鈴木方翅網(wǎng)蝽（Corythucha ciliata）是一種世界性城市森林害蟲，目前該蟲在我國大部分城市均有發(fā)生，其具有擴(kuò)散速度快、危害程度嚴(yán)重等特性，一旦傳入新的地區(qū)，能形成相當(dāng)穩(wěn)定的高密度種群，成為懸鈴木屬植物上的常發(fā)性主要害蟲，并難以控制［1］。筆者在開展懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的自然天敵種類調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，軍配盲蝽（Stethoconus japonicus）是懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的優(yōu)勢捕食性天敵，其主要以成若蟲捕食懸鈴木方翅網(wǎng)蝽，在懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的為害期均可見。前期研究也發(fā)現(xiàn)，軍配盲蝽成蟲對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的日捕食量高達(dá)27頭［2］。生物防治是害蟲綜合防治的重要措施，也是綠色防控的重要組成部分。軍配盲蝽作為網(wǎng)蝽類害蟲的重要天敵昆蟲，其在網(wǎng)蝽類害蟲的生物防治過程中具有重要的利用潛力和價值，可用于防治綠化林業(yè)中的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽、杜鵑網(wǎng)蝽（Stephanitis pyrioides）、樟脊冠網(wǎng)蝽（Stephanitis macaona）、梨網(wǎng)蝽（Stephanitis nashi）和農(nóng)業(yè)上的茶脊冠網(wǎng)蝽（Stephanitis chinensis）等。目前關(guān)于軍配盲蝽的研究報道相對較少，各報道在該天敵若蟲的生物學(xué)特性細(xì)節(jié)描述上還存在一定分歧［3-6］。關(guān)于軍配盲蝽的鑒定僅限于傳統(tǒng)形態(tài)特征描述，且已有的報道和野外調(diào)查也發(fā)現(xiàn)，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的天敵中還存在與軍配盲蝽易混淆的種類，如紀(jì)銳等［7］在杭州調(diào)查懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的自然天敵種類時，發(fā)現(xiàn)一種天敵齒爪盲蝽屬Deraeocoris sp.。近年來在調(diào)查軍配盲蝽發(fā)生規(guī)律時，筆者發(fā)現(xiàn)一種軍配盲蝽的近似種，具體種類未知。為進(jìn)一步明確軍配盲蝽的種類及其分類地位和生物習(xí)性，對軍配盲蝽分子鑒定和生物學(xué)特性開展了觀察研究，以期為軍配盲蝽的研究和開發(fā)利用提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 分子生物學(xué)鑒定

軍配盲蝽成若蟲標(biāo)本采集于浦東新區(qū)民春路懸鈴木植株，采集時間為 2021 年7月，并在實驗室飼養(yǎng)，獲取不同蟲態(tài)后用75%乙醇保存，用于形態(tài)特征觀察，部分標(biāo)本用無水乙醇保存，用于分子生物學(xué)鑒定。

DNA提取使用單頭軍配盲蝽成蟲樣本，采用天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）進(jìn)行提取。提取產(chǎn)物加入TE buffer 后，-20 ℃冰箱保存待用。

PCR擴(kuò)增采用線粒體DNA細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome oxidase c subunit I，COI）基因通用引物：LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）。擴(kuò)增體系采用25 μL反應(yīng)體系，包含2.5 μL Mg2+，2.5 μL 10×Buffer，4.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），1.0 μL DNA模板，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL，剩余為ddH2O。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s；51 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海派森諾生物科技有限公司測序。

在NCBI數(shù)據(jù)庫（National Center for Biotechnologgy Information，http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中，用測序獲得的COI基因片段進(jìn)行BLAST序列比對和同源性分析。用MEGA-X軟件以鄰接法（neighbor joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用1 000次重復(fù)抽樣進(jìn)行Bootstrap檢驗各分支的置信度，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的COI基因序列設(shè)置為外群。

1.2 形態(tài)及生物學(xué)特性觀察

在養(yǎng)蟲盒（長12 cm×寬6 cm×高6 cm）中放入帶有懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的懸鈴木葉片，葉柄用棉球保濕，將野外采回的軍配盲蝽成蟲釋放于養(yǎng)蟲盒中，并加入蘸有5%蜂蜜水棉球供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)。將初孵若蟲接入懸鈴木葉片上，并接入一定量的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽供成若蟲捕食，定期更換懸鈴木葉片，每24 h觀察并記錄卵、若蟲和成蟲的發(fā)育情況和捕食行為，并利用索尼A6000數(shù)碼攝像系統(tǒng)對各蟲態(tài)進(jìn)行拍攝記錄，以初孵若蟲30頭開始試驗。觀察試驗在室溫為28 ℃養(yǎng)蟲室內(nèi)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學(xué)鑒定

2.1.1 軍配盲蝽COI序列分析。

測序獲得692 bp的COI序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，生成基因登錄號（Genbank number）：OP143756。通過NCBI中BLAST比對，發(fā)現(xiàn)OP143756與數(shù)據(jù)庫中的軍配盲蝽Stethoconus japonicus的COI（KY367030.1，KY367031.1）序列的相似性達(dá)100%（圖1），但所比對序列與目標(biāo)序列的覆蓋度僅73%。

結(jié)合COI擴(kuò)增通用引物序列，采用Bioedit 7.0 軟件對序列KY 367030.1、KY367031.1及該研究提交的COI序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)Genbank數(shù)據(jù)庫中已有的軍配盲蝽COI序列并不完整（圖2）。

2.1.2 軍配盲蝽COI序列進(jìn)化樹構(gòu)建。

采用MEGA-X以鄰接法構(gòu)建基于COI基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，利用自展法（Bootstrap，1 000次重復(fù)）檢驗各分支的置信度，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽COI序列KP420523.1作為外群。從圖3可知，懸鈴木方翅網(wǎng)蝽與盲蝽科很好地區(qū)分開，盲蝽科分支下的部分盲蝽能較好地聚集，且盲蝽亞科與軍配盲蝽Stethoconus japonicus聚類于盲蝽科下同一個分支。

2.2 生物學(xué)特性

2.2.1 形態(tài)特征。

2.2.1.1 卵。軍配盲蝽產(chǎn)卵于葉背主脈內(nèi)，白色卵蓋外露。卵形似茄子，略彎曲，長0.7 mm，寬0.2 mm。初產(chǎn)卵白色透明，即將孵化的卵淡紅色（圖4a～c）。

2.2.1.2 若蟲。軍配盲蝽若蟲共5齡，初孵若蟲淡紅色，體長0.6～0.8 mm，2齡翅芽顯露，3齡開始若蟲體色發(fā)白，4齡翅芽伸至第5腹節(jié)，5齡翅芽伸至第7腹節(jié)。口器刺吸式，活動較敏捷（圖4d～h）。

2.2.1.3 成蟲。軍配盲蝽成蟲體長3.0～4.0 mm，寬1.5 mm，黑褐色，口器刺吸式，觸角各節(jié)上端深褐色，第2節(jié)特別明顯。前胸背板上密生刻點(diǎn)，有淺褐色“＊”斑紋。小盾片呈三角形凸起，前翅中前部有1 條黑色不規(guī)則橫紋斑，上下有白斑。雌成蟲腹面有淺褐色斑；雄成蟲腹部末端略尖削，體型略小（圖4i～k）。

2.2.2 軍配盲蝽對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的捕食行為。

軍配盲蝽成若蟲在饑餓情況下搜尋到懸鈴木方翅網(wǎng)蝽，試探幾次后，會迅速用口器刺入懸鈴木方翅網(wǎng)蝽身體將其麻醉，待其掙扎不動后再進(jìn)行取食。軍配盲蝽成若蟲在取食過程中會改變?nèi)∈巢课唬瑢意從痉匠峋W(wǎng)蝽體液吸食殆盡，只留下干癟表皮。軍配盲蝽捕食時對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽有拖拽行為。此外，其成若蟲在食物和水分缺乏時，存在嚴(yán)重的自殘現(xiàn)象。

2.2.3 軍配盲蝽若蟲的發(fā)育歷期。

軍配盲蝽若蟲的發(fā)育歷期見表1，由表1可知，在28 ℃下，軍配盲蝽若蟲共5齡，各齡若蟲平均歷期分別為2.1、2.1、1.2、2.2、4.1 d，整個若蟲期平均歷期為11.6 d，最短11.0 d，最長14.0 d。

3 結(jié)論與討論

半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae所包含的種類已成為半翅目中最豐富的科之一，數(shù)量達(dá)到10 000余種。關(guān)于盲蝽科類群的劃分及其相互間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較為復(fù)雜，不同學(xué)者提出不同意見［8-10］。該研究通過分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)日常調(diào)查發(fā)現(xiàn)的懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的優(yōu)勢天敵種類與數(shù)據(jù)庫中的軍配盲蝽Stethoconus japonicus的COI（KY367030.1，KY367031.1）序列的相似性達(dá)100%，進(jìn)一步復(fù)核了該天敵的傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。Schuh［10］曾提出將盲蝽科分為6個亞科的分類系統(tǒng)，并發(fā)表了盲蝽亞科水平的系統(tǒng)發(fā)育樹。該系統(tǒng)發(fā)育支持盲蝽亞科Mirinae與齒爪盲蝽亞科Deaeocorinae的姐妹群關(guān)系。軍配盲蝽分類地位為半翅目盲蝽科齒爪盲蝽亞科透齒爪盲蝽族軍配盲蝽屬。該研究構(gòu)建的發(fā)育樹表明，軍配盲蝽與盲蝽亞科的關(guān)系較近，這也證明了盲蝽亞科與齒爪盲蝽亞科為姐妹群關(guān)系的結(jié)論。

目前，關(guān)于軍配盲蝽的研究資料較少，現(xiàn)有的報道關(guān)于若蟲齡期也存在一定分歧，江宏燕等［6］研究認(rèn)為，若蟲共4齡，羅優(yōu)［11］研究認(rèn)為，若蟲共5齡。該研究飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，軍配盲蝽若蟲共5齡，若蟲期為若蟲期平均歷期為11.6 d，最短11.0 d，最長14.0 d。飼養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，軍配盲蝽的卵散產(chǎn)于主脈內(nèi)，而非卵塊，這與羅優(yōu)［11］的研究結(jié)果存在差異。7月野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，軍配盲蝽發(fā)育一個完整世代需30 d時間，這與羅優(yōu)［11］研究結(jié)果吻合。

軍配盲蝽成蟲對懸鈴木方翅網(wǎng)蝽成蟲的日捕食量高達(dá)27頭［2］，遠(yuǎn)高于黃帶犀獵蝽成蟲對斜紋夜蛾3、4齡幼蟲的最大捕食量（分別為 14.5、7.3頭）［12］，對于懸鈴木方翅網(wǎng)蝽的生防應(yīng)用潛力巨大。該研究通過室內(nèi)飼養(yǎng)觀察研究了軍配盲蝽的捕食行為和發(fā)育歷期等生物學(xué)特性，為今后繁殖及野外林間運(yùn)用軍配盲蝽防治懸鈴木方翅網(wǎng)蝽提供了新的研究基礎(chǔ)，天敵的大量繁殖和釋放是其開發(fā)和利用的主要途徑，相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

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