頂空氣相色譜法測定6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮殘留量

齊秋煥 黃春華 鄭學學 韓 菲 王翠杰 李向群

北京民海生物科技有限公司，北京 102600

肺炎鏈球菌為革蘭氏陽性菌，有毒株在體內形成莢膜，其莢膜多糖為重要致病物質，可引起肺炎、腦膜炎、支氣管炎、心內膜炎等疾病[1-3]。23 價肺炎球菌多糖疫苗能有效預防老年人下呼吸道感染[4-7]。肺炎球菌精制多糖是生產各種肺炎類疫苗的基本成分。肺炎球菌精制多糖生產過程中沉淀核酸、粗制多糖和精制多糖引入乙醇，在清洗粗制多糖和精制多糖時引入丙酮。乙醇略有毒性，能達到一定的麻醉效果，主要抑制中樞神經系統。當乙醇攝入量增大時，可引起延髓血管運動中樞和呼吸中樞麻痹。丙酮為低毒類致癌物，主要對中樞神經系統有麻醉作用[8]。它們對人體有一定危害，因此必須控制乙醇、丙酮殘留量。目前，國內對于化學藥、原料藥中有機溶劑殘留量檢測已有相關文獻記載[9-17]，但關于疫苗中有機溶劑殘留量檢測方法文獻較少[18]，且尚未有肺炎球菌精制多糖測定乙醇、丙酮殘留量的方法[8,19-24]。因此，本研究采用頂空氣相色譜法對6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮殘留量檢測方法進行方法學驗證，按照外標法方法進行計算。

1 儀器與試藥

1.1 試劑及儀器

6B 型肺炎球菌精制多糖（樣品批號：38-6B-22202001、38-6B-22203002、38-6B-22203003、38-6B-22204004、38-6B-22205005、38-6B-22206006、38-6B-22206007、38-6B-22210008、38-6B-22210009，北 京民海生物科技有限公司）；無水乙醇對照品（批號：20170522，氣相色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；丙酮對照品（批號：20170511，氣相色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；實驗室用水為注射用水和純化水。氣相色譜儀（GC-2010 Plus AF，島津公司）；頂空進樣器（HS-20，島津公司）；DB-624 毛細管柱（30 m×0.25 mm 膜厚1.80 μm，Agilent Technologies）。

1.2 溶液制備

1.2.1 供試品溶液 用純化水將6B 型肺炎球菌精制多糖溶解成5 000 μg/ml 的溶液。

1.2.2 乙醇、丙酮對照品貯備液 稱取無水乙醇210 mg、丙酮280 mg 加入100 ml 容量瓶中，用注射用水定容至刻度。搖勻，得到2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml 丙酮對照品貯備液。

1.2.3 乙醇、丙酮對照品溶液 量取2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml 丙酮對照品貯備液1 ml 到100 ml 容量瓶中，用注射用水定容至刻度，搖勻，得到21 μg/ml 乙醇、28 μg/ml 丙酮對照品溶液。

1.3 色譜條件

采用頂空進樣器使用DB-624 毛細管色譜柱（Agilent Technologies），載氣為高純氮氣，色譜柱流量為3.00 ml/min，分流比為10∶1。起始柱溫為40℃，保持2 min；以5℃/min 升溫至80℃，保持4 min；以20℃/min 升溫至200℃，保持2 min。檢測器溫度為240℃。恒溫爐溫度為80℃、平衡時間為30 min。

2 方法與結果

2.1 系統適用性試驗

取21 μg/ml 乙醇、28 μg/ml 丙酮對照品溶液5份，每份2 ml 置20 ml 頂空瓶中。按照“1.3”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。乙醇峰、丙酮峰的理論板數均≥5 000，乙醇峰、丙酮峰分別與其相鄰色譜峰的分離度均≥1.5，符合《中華人民共和國藥典》[25]四部留溶劑測定法的要求。

2.2 專屬性

肺炎球菌精制多糖制備過程中按照特定比例使用苯酚抽提去除蛋白質，經過離心剩余苯酚量最大≤10%，再經過超濾過程基本能將苯酚去除[26]。分別配制一定濃度乙醇溶液和丙酮溶液，并配制為乙醇含10%苯酚的溶液、丙酮含10%苯酚的溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖含10%苯酚的溶液。分別取乙醇溶液、丙酮溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖溶液、苯酚、乙醇含10%苯酚的溶液、丙酮含10%苯酚的溶液、6B 型肺炎球菌精制多糖含10%苯酚的溶液2 ml 置20 ml 頂空瓶中，按照“1.3”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。乙醇保留時間約為2.413 min、丙酮保留時間約為2.794 min、苯酚保留時間約為18.776 min，且所有峰均達到分離，分離度應＞1.5。見圖1。苯酚的保留時間遠大于乙醇、丙酮的保留時間，提示，苯酚對乙醇、丙酮殘留量檢測無干擾。

圖1 氣相色譜圖

2.3 檢測限（limit of detection，LOD）與定量限（limit of quantitation，LOQ）

先分別配制10 μg/ml 乙醇溶液和10 μg/ml 丙酮溶液，再采用逐步稀釋法將其分別稀釋到0.596、0.199、0.152、0.051 μg/ml。按照“1.3”項下色譜條件進行檢測，以信噪比3∶1 作為LOD；以信噪比10∶1 作為LOQ[25]。在該方法條件下，乙醇的LOD 為0.199 μg/ml，LOQ 為0.596 μg/ml；丙酮的LOD 為0.051 μg/ml，LOQ 為0.152 μg/ml。

2.4 線性范圍

將“1.2.2”中對照品貯備液用純化水分別稀釋乙醇濃度為0.090、3.000、12.000、21.000、30.000 μg/ml的溶液，丙酮濃度為0.120、4.000、16.000、28.000、40.000 μg/ml 的溶液，按“1.3”項下色譜條件進行檢測，結果顯示乙醇的線性方程式為Y=2 276.471 86X-265.405 07，相關系數r=0.999 99，線性范圍為0.090～30.000 μg/ml，表明乙醇對照品色譜峰峰面積與其濃度呈線性關系，乙醇標準曲線見圖2；丙酮的線性方程式為Y=7790.898 42X+4 216.806 23，相關系數r=0.998 13，線性范圍為0.120～40.000 μg/ml，表明丙酮對照品色譜峰峰面積與濃度呈線性關系，丙酮標準曲線見圖3。

圖2 乙醇線性范圍標準曲線

圖3 丙酮線性范圍標準曲線

2.5 準確度

取6B 型肺炎球菌精制多糖溶液4 ml 置離心管中，共12 份。其中3 份分別加純化水6 ml。剩余9 份，分成3 組，每組分別量取2 100 μg/ml 乙醇、2 800 μg/ml丙酮對照品貯備液0.050、0.100、0.150 ml，再分別加純化水5.950、5.900、5.850 ml。考察供試品低、中、高3個濃度的加標回收率。每份2 ml 置20 ml 頂空瓶中，按照“1.3”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。

供試品低、中、高3 個濃度的加標回收率乙醇為86.20%～100.66%，丙酮82.89%～91.42%；RSD 乙醇為1.88%～6.44%，丙酮為3.84%～4.50%。見表1。表明在該檢測條件下乙醇、丙酮準確度較高，則系統誤差較小。計算公式為：回收率（%）=（測定值-初始值）/加入量×100。

表1 6B 型肺炎球菌精制多糖溶液準確度結果

2.6 重復性

取6B 型肺炎球菌精制多糖溶液6 份，每份取2 ml置20 ml 頂空瓶中，按照“1.3”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。在相同條件下，由同一人對6B 型肺炎球菌精制多糖溶液試驗6 次，供試品RSD 乙醇為2.3%，丙酮為5.5%。表明在同一條件下，采用該檢測方法乙醇、丙酮殘留量重復性良好。

2.7 重現性

在不同時間，由甲、乙、丙3 人對6B 型肺炎球菌精制多糖溶液共試驗3 次，供試品RSD 乙醇為7.2%，丙酮為4.2%。表明不同時間，不同人員檢測乙醇、丙酮殘留量重現性良好。

2.8 樣品測定

取9 批6B 型肺炎球菌精制多糖按照儀器與試藥中的“1.3”色譜條件進行乙醇、丙酮殘留量檢測。測定結果見表2。表明6B 型肺炎球菌精制多糖乙醇、丙酮殘留量均較低。

表2 6B 型肺炎球菌精制多糖測定結果

3 討論

乙醇的沸點為78.3℃，易溶于水；丙酮的沸點為56.5℃，易溶于水。因此可采用水溶解樣品，同時使用氣相色譜法進行乙醇、丙酮的檢測。由于6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮含量很低，因此采用頂空氣相色譜法檢測乙醇、丙酮殘留量。

本研究結果表明，乙醇、丙酮理論板數≥5 000，分離度≥1.5，表明各組分可得到較好的分離，系統的適用性良好；苯酚對6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮殘留量檢測沒有干擾；乙醇的LOD 為0.199 μg/ml，LOQ 為0.596 μg/ml；丙酮的LOD 為0.051 μg/ml，LOQ為0.152 μg/ml，表明在定量限以上能定量測定乙醇、丙酮的殘留量。6B 型肺炎球菌精制多糖對低、中、高3 個濃度加標回收法測得回收率乙醇為86.20%～100.66%，丙酮為82.89%～91.42%，表明該方法具有良好的準確性。重復性RSD 乙醇為2.3%，丙酮為5.5%，表明該方法具有良好的重復性；重現性RSD 乙醇為7.2%，丙酮為4.2%，表明該方法具有良好的重現性；乙醇的線性回歸方程式為Y=2 276.471 86X-265.40507，相關系數r=0.999 99，線性范圍為0.090～30.000 μg/ml，表明乙醇對照品色譜峰面積與濃度呈線性關系；丙酮的線性回歸方程式為Y=7 790.898 42X+4 216.806 23，相關系數r=0.998 13，線性范圍為0.120～40.000 μg/ml，表明丙酮對照品色譜峰面積與濃度呈線性關系。

因此，使用該方法檢測6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮的殘留量結果可靠、操作方便。可用于6B 型肺炎球菌精制多糖中乙醇、丙酮的殘留量。