蘿卜VQ1基因的克隆與序列分析

霍燕琦　李紫薇　張文靜　徐銘婕　劉同金

摘要 利用RT-PCR技術克隆了蘿卜（Raphanus sativus L.）VQ1基因CDS序列，并對其進行測序和生物信息學分析。結果表明，RsVQ1開放閱讀框長861 bp，編碼286個氨基酸殘基，相對分子量為31.3 kD，理論等電點為6.49，脂肪指數為62.69，為不穩定的親水性蛋白，無跨膜結構和信號肽。RsVQ1蛋白主要由無規則卷曲結構構成，預測其可定位于細胞核。系統發育分析表明該蛋白與十字花科作物VQ蛋白存在較高同源性。本研究為RsVQ1的表達和基因功能研究奠定了基礎。

關鍵詞 蘿卜；VQ1基因；基因克隆；生物信息學

中圖分類號 S631.1? ?文獻標識碼 A

文章編號 1007-7731（2023）10-0042-05

Cloning and sequence analysis of VQ1 gene in radish

HUO Yanqi? ?LI Ziwei? ?ZHANG Wenjing? ?XU Mingjie? ?LIU Tongjin*

（College of Horticulture，Jinling Institute of Technology，Nanjing Jiangsu 210000）

Abstract The full length coding sequence of VQ1 gene was cloned from radish （Raphanus sativus L.） by reverse transcription-PCR amplification and analyzed by bioinformatics. The results showed that the open reading frame （ORF） of RsVQ1 gene is 861 bp，encoding 286 amino acids with a molecular weight of 31.3 kD，isoelectric point of 6.49 and aliphatic index of 62.69. It was predicted to encode an unstable hydrophilic protein，and with no transmembrane structure or signal peptide. The protein structure of RsVQ1 is mainly composed of random coiled structures. Protein subcellular localization prediction results showed that it was probably localized in the nucleus. Phylogenetic analysis showed that RsVQ1 is closely related to Brassicaceae homologous proteins. Present study provides a basis for exploring the expression and function of RsVQ1 gene in the future.

Keywords radish; VQ1 gene; gene clone; bioinformatics

VQ蛋白是植物中廣泛存在的一類轉錄輔助蛋白[1]，因其含有高度保守的VQ基序（FxxhVQxhTG）而得名，其中x和h分別代表任意氨基酸和疏水性氨基酸[2]。基因結構分析發現，高等植物中多數VQ基因不含內含子，而苔蘚基因組中包含的18個VQ基因均至少含有一個內含子[3]。

研究表明，VQ蛋白參與植物不同發育過程的調控，包括光形態的建成，種子、花、葉和下胚軸的發育及對生物和非生物脅迫的響應[3]。VQ家族蛋白可以通過其保守的V和Q殘基與WRKY轉錄因子互作，進而調控下游一系列的生理生化過程[4]。鹽脅迫特異性誘導AtVQ9上調表達，并與AtWRKY8互作而調控植物的耐鹽性[5]。此外，ABA、高鹽、高滲透壓及低溫或高溫脅迫誘導與AtWRKY8互作的AtVQ10、AtVQ11和AtVQ23/SIB1編碼基因顯著上調表達，表明其可能參與植物對多種非生物逆境調控[6]。轉錄因子AtWRKY2和AtWRKY34與AtVQ20蛋白互作調控花粉萌發、發育及花粉管的伸長[7]，AtVQ14可與VQ基序蛋白IKU1互作調節種子大小和胚乳發育[8]，表明VQ蛋白參與植物發育過程的調控。VQ基因家族成員在對病原菌的防御過程中也發揮著重要作用[9]。丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染誘導擬南芥AtVQ23/SIB1上調表達，其功能缺失突變會抑制SA和JA介導的防御反應[10]。AtVQ16/SIB2和AtVQ23/SIB1可增強AtWRKY33的DNA結合活性以增強植株對真菌病的防御能力[4]，且過表達AtVQ23可增強植株對丁香假單胞菌的抗性[10]。AtVQ12、AtVQ22和AtVQ29負調控植物對灰霉菌（B. cinerea）的抗性[11]，而VQ10與WRKY8互作增強擬南芥對灰霉病的基礎防御[12]。

蘿卜（Raphanus sativus L.）是一種重要的蔬菜作物，具有較高的食用與藥用價值，在世界范圍內被廣泛栽培。其生長發育過程常遭受多種生物及非生物脅迫，極大影響了產量與品質，已成為蘿卜種植生產過程中亟需解決的問題。然而，目前有關蘿卜對生物及非生物脅迫的抗性機制研究較少，制約了其遺傳改良進程。前人研究表明VQ基因家族成員廣泛參與植物對生物和非生物脅迫的響應，但尚未見有關于蘿卜VQ基因的報道。本研究克隆了蘿卜VQ1基因，并進行測序和生物信息學分析，將為下一步RsVQ1的表達調控和功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為‘心里美蘿卜高代自交系，種植于金陵科技學院園藝站，取成熟期肉質根置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成。使用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）進行總RNA的提取，經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）將其反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.2.2 引物設計與PCR擴增。根據已發表的蘿卜基因組數據，設計并合成RsVQ1基因特異性引物VQ1-InF（CACCATGCAATCTTCAAGCGGCG）和VQ1-InR（CGAGGCGTGAAAGATGCGT），以cDNA為模板，使用KOD-Plus-Neo高保真酶（TOYOBO CO.，LTD）進行RsVQ1基因的PCR擴增。PCR反應體系為cDNA模板2 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 μmol/L Forward Primer 1.5 μL，10 μmol/L Reverse Primer 1.5 μL，2 mM dNTPs 5 μL，酶（1U） 1 μL，ddH₂O補充至50 μL；PCR擴增程序使用兩步法：94 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，68 ℃延伸30 s，進行35個循環。

1.2.3 目的片段的回收、載體構建與測序。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根生化科技有限公司）對目的片段進行切膠回收，并將其連接到pENTER-TOPO為載體（Invitrogen），重組產物通過熱激發轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固體基中過夜培養，挑取單克隆進行搖菌和菌液PCR，篩選陽性克隆送上海生工進行Sanger測序。

1.2.4 生物信息學分析。利用ExPASy-ProtScale在線軟件翻譯堿基序列，并分析其分子式、分子量、理論等電點（PI）、不穩定系數、脂肪系數、親疏水性；使用NovoPro在線工具預測其跨膜結構與信號肽序列；使用SPOMA在線工具預測其二級結構；使用Plant-mPLoc在線軟件預測其亞細胞定位；采用NCBI中Conserved Domains 在線工具對RsVQ1蛋白保守結構域進行預測；使用NetPhos-3.1在線工具對RsVQ1蛋白磷酸位點進行預測；利用NCBI中Blast工具獲取其他物種同源蛋白序列，運用MEGA軟件進行系統發育進化樹的構建（Neighbor-joining法，Bootstrap值設置為1 000）。

2 結果與分析

2.1 RNA提取及RsVQ1基因擴增

對‘心里美蘿卜肉質根提取出的RNA進行電泳檢測（圖1），結果表明提取質量較好，條帶清晰，可用于后續試驗。以其反轉錄成的cDNA為模板，PCR擴增出了861 bp的目的條帶（圖2）。

2.2 RsVQ1蛋白的理化性質分析

將測序獲得的RsVQ1堿基序列翻譯成氨基酸并對其進行序列分析，結果表明：RsVQ1編碼286個氨基酸，其中Asn（N）、Ser（S）和Leu（L）含量較高，分別為11.9%、14.3%和9.1%；Cys（C）與Trp（W）含量最低，均為0.3%。該蛋白分子式為C1345H2092N404O451S5，分子量大小為31.3 kD，理論等電點（PI）為6.49，不穩定系數為72.08，脂肪指數為62.69，總平均親水性為-0.748，說明其為不穩定的親水性蛋白。ProtScale預測表明RsVQ1親水區含量高于疏水區，進一步說明其為親水性蛋白。NovoPro預測結果表明，RsVQ1蛋白無跨膜結構、無信號肽，表明其為非分泌性蛋白。

2.3 RsVQ1蛋白空間結構預測及亞細胞定位

SPOMA預測表明RsVQ1蛋白二級結構中無規則卷曲、延伸鏈、α-螺旋和β-折疊所占比例分別為55.94%、20.28%、17.83%和5.94%（圖3）。Plant-mPLoc在線軟件預測RsVQ1蛋白極可能定位于細胞核。

2.4 RsVQ1蛋白保守結構域及磷酸化位點預測

使用NCBI中Conserved Domains在線工具預測發現RsVQ1蛋白具有一個VQ保守結構域。NetPhos-3.1預測RsVQ1蛋白有44個磷酸化位點，其中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸磷酸化位點分別有31、10和3個（圖4）。

2.5 RsVQ1蛋白的系統進化分析

為研究蘿卜RsVQ1與其他植物蛋白的系統進化關系，利用MEGA軟件構建了RsVQ1與14個不同物種的系統進化樹（圖5）。結果發現，RsVQ1與白芥（Sinapis alba）、甘藍型油菜（Brassica napus）、甘藍（Brassica oleracea ）、白菜（Brassica rapa）和芝麻菜（Eruca vesicaria subsp. sativa）等十字花科植物的同源蛋白聚為一類，表明蘿卜RsVQ1與十字花科植物同源蛋白的親緣關系較近，而與醉蝶花（Tarenaya hassleriana）、苦菊（Cichorium endivia）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis）和旋蒴苣苔（Dorcoceras hygrometricum）的親緣關系相對較遠。

3 討論與結論

前人研究表明，VQ基因家族成員在調控植物生長發育和逆境響應過程中均發揮重要作用。秈稻（Oryza sativa subsp. Indica）多個OsMHVQs響應溫度脅迫[13]，甜瓜（Cucumis melo L.）中6個VQ家族基因響應白粉病菌侵染[14]，鹽脅迫誘導普通煙草（Nicotiana tabacum）NtVQ16和NtVQ52基因顯著上調表達，NtVQ9、NtVQ46、NtVQ23和NtVQ26響應青枯菌的侵染，推測其可能參與煙草對青枯菌的免疫防御調控[15]，小麥（Triticum aestivum）VQ家族部分成員響應高溫與干旱脅迫[16]。此外，研究表明多種植物VQ1基因參與對生物和非生物脅迫的響應。茉莉酸、脫落酸和低溫處理誘導香蕉（Musa paradisiaca）MaVQ1顯著上調表達，高溫與干旱抑制其表達水平[17]；青杄（Picea wilsonii M.）VQ1基因參與溫度、干旱、ABA、鹽脅迫等多種非生物脅迫的響應[18]；侯俊斌[19]發現棉花（Anemone vitifolia Buch）GhVQ1在根中具有較高的表達水平，且受植物抗病相關激素水楊酸與茉莉酸的影響，抑制其表達可降低棉花對枯萎病的敏感性。

目前蘿卜VQ基因相關研究尚未見有報道，基于前人對VQ基因功能的研究，推測蘿卜VQ基因可能參與調控植株的生長發育及生物與非生物脅迫的響應。本研究從‘心里美蘿卜中克隆出RsVQ1基因，并對其進行生物信息學分析，RsVQ1蛋白為不穩定的親水性非分泌性蛋白，無跨膜結構，含有VQ保守結構域，具有44個磷酸化位點。蛋白質二級結構主要為無規則卷曲結構，其次為延伸鏈結構，亞細胞定位預測表明該蛋白極可能存在于細胞核中。RsVQ1蛋白與白芥、芝麻菜等十字花科物種的同源性較高。本研究為進一步解析RsVQ1基因的功能和表達調控機制奠定了基礎。

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（責編：王 菁）