液相色譜-質譜-質譜聯用儀測定花生油中黃曲霉毒素B1

周琴 劉新月 李紹仙 張曉花 譚文涵

摘 要：目的：采用液相色譜-質譜-質譜聯用儀建立花生油中黃曲霉毒素B1的檢測方法。方法：樣品提取經免疫親和柱凈化，以甲酸水和乙腈為流動相，采用phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A色譜柱

（100 mm×3.0 mm）梯度洗脫分離，多重反應監測模式對花生油中黃曲霉毒素B1進行定性分析，同位素內標法定量。結果：黃曲霉毒素B1在1～20 ng·mL-1線性內呈良好線性關系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、

5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對標準偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測定花生油中黃曲霉毒素B1質控樣，檢測結果在質控樣范圍內。結論：該檢測方法簡便快捷、無需衍生、特異性強，靈敏度高且線性關系良好，準確度和精密度均滿足定量分析的要求，適用于花生油中黃曲霉毒素B1的定量分析。

關鍵詞：液相色譜-質譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS）；黃曲霉毒素B1；花生油

Determination of Aflatoxin B1 in Peanut Oil by LC-MS-MS

ZHOU Qin， LIU Xinyue*， LI Shaoxian， ZHANG Xiaohua， TAN Wenhan

（Puer Comprehensive Technical Testing Center， Puer 665000， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1 in peanut oil by LC-MS/MS. Method： The sample was extracted and purified by an immunoaffinity column. Formic acid water and acetonitrile were used as mobile phases， and the gradient elution separation was carried out on the phenomenx Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A chromatographic column （100 mm×3.0 mm）.The qualitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil was carried out by multiple reaction monitoring mode， and the quantity was determined by isotope internal standard. Result： Aflatoxin B1 showed a good linear relationship in the linear range of 1～20 ng·mL-1 （R2=0.999 3）， at the spiked levels of 2.0 μg·kg-1， 5.0 μg·kg-1 and 10.0 μg·kg-1， the average recovery rate was 94.1%～107.4%， and the relative standard deviation （n=6） was 5.6%～9.3% . The method was used to determine aflatoxin B1 quality control samples in peanut oil， and the detection results were within the range of quality control samples. Conclusion： This detection method is simple， fast， does not require derivatization， has strong specificity， and has high sensitivity and good linear relationship. The accuracy and precision meet the requirements of quantitative analysis， and is suitable for the quantitative analysis of aflatoxin B1 in peanut oil.

Keywords： liquid chromatography tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）; aflatoxin B1; peanut oil

花生油含有豐富的不飽和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白膽固醇水平，而不會破壞高密度脂蛋白，有助于維持血脂平衡，預防心血管疾病[1]。此外，油酸還具有抗炎、預防肥胖、預防衰老、預防動脈硬化和增強自身免疫力的功能[2-3]。然而，在對人體有益的同時，花生油也存在安全隱患。黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是造成花生油污染的主要原因之一[4]，在自然界中其主要以黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2存在，具有強毒性、致癌性、致畸性和致突變性，而黃曲霉毒素B1（AFB1）含量最高[5-6]。何景等[7]2019年在抽檢北京小包裝花生油時，黃曲霉毒素檢出率為26.67%。胡振等[8]在對2016—2017年廣西14個地級市抽檢食用植物油樣品時發現，花生油中黃曲霉毒素B1檢出率達到8.85%，花生油合格率僅為87.83%。真菌毒素是對人和動物有嚴重慢性毒性的物質[9]，如果大量攝入或長期少量攝入黃曲霉毒素，可能會導致慢性中毒、增加致癌風險。因此，研究花生油中黃曲霉毒素B1的檢測方法具有重要意義。

黃曲霉毒素檢測方法有酶聯免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[10]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11]等，酶聯免疫吸附法簡單、快速、特異性高，但假陽性較多；高效液相色譜法具有良好的準確性和高靈敏度，但需要衍生，檢測周期長，且較浪費溶劑。液相色譜-質譜-質譜聯用儀（LC-MS/MS）特異性強，定性定量準確，檢出限低，從而被廣泛應用于農殘、獸殘以及真菌毒素類的痕量檢測領域[12-15]。黃曲霉毒素的離子化狀態可利用電噴霧離子源實現，電噴霧離子源有正、負離子兩種模式，在正離子模式下效果最好[16]，因此，黃曲霉毒素離子化模式為ESI+。黃曲霉毒素凈化小柱包括兩個類型：多功能凈化柱與免疫親和柱。其中，多功能凈化柱采用復合材料，可以吸附蛋白質、色素等[16]。盡管這種方法的凈化速度相對較快，但不能全面有效地消除干擾物質。因此，在實際實驗中，多使用免疫親和柱來凈化樣品。本研究利用液相色譜-質譜-質譜聯用儀對花生油中黃曲霉毒素B1進行定量分析，并對實驗條件進行了探討。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-質譜-質譜聯用儀（3200QTRAP，美國AB Scies）；色譜柱（phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A，100 mm×3.0 mm）；3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；渦旋攪拌混勻器（英國Grant公司）；AL204電子天平（瑞士梅特勒）；IKA HS501振蕩器（德國IKA儀器設備有限公司）；N-EVAP-24氮吹儀（美國Organomation公司）；微量可調移液槍（0.1～1.0 mL，德國Eppendorf公司）。

花生油，購于沃爾瑪超市。黃曲霉毒素

B1（100 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；黃曲霉毒素B1內標液（0.5 μg·mL-1，天津阿爾塔科技有限公司）；乙腈（色譜純，德國 Merck 公司）；黃曲霉毒素B1免疫親和柱（普瑞邦公司）；質控樣[MRM-AO，質控值范圍為（12.44±1.38）μg·kg-1，普瑞邦]；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準使用液配制

準確移取1 mL濃度為100 μg·mL-1的標準儲備液，用甲醇定容至10 mL，配制濃度為10 μg·mL-1的標準儲備液，再準確移取1 mL濃度為 10 μg·mL-1的標準儲備液用甲醇定容至10 mL，配制濃度為1 μg·mL-1的標準中間液，分別吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和20 μL標準中間液于1 mL進樣瓶中，并同時加入40 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，用初始流動相定容至1 mL配制系列標準工作液濃度為1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1。

1.2.2 樣品前處理

準確稱取5 g試樣于50 mL離心管中，加入

20 μL濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1標準品和200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，加入20 mL乙腈-水溶液（80+20），渦旋混勻，置于振蕩器振蕩20 min，離心，取上清液備用。準確移取4 mL上清液，加入46 mL 0.1%吐溫-20 PBS溶液混勻，將待凈化液轉移至50 mL注射器筒內，以恒定流速流經已活化的免疫親和柱，20 mL超純水淋洗免疫親和柱，真空泵抽干。2 mL甲醇洗脫黃曲霉毒素B1免疫親和柱，真空泵抽干全部親和柱，在水浴條件下將洗脫液濃縮至近干，初始流動相定容至

1 mL，過0.22 μm濾膜，濾入樣品瓶上機測定。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl-100A色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.6 ?m），進樣量10.0 μL；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液；柱溫35 ℃，梯度洗脫程序見表1。

質譜條件：離子化模式ESI+，電子能量70 eV；離子源溫度280 ℃；接口溫度280 ℃；掃描方式多反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

2 結果與分析

2.1 儀器分析參數

將體積濃度為1 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1和內標單標分別通過質譜儀所配的外置進樣泵進樣，分別尋找其母離子和子離子并優化碰撞電壓和去簇電壓。黃曲霉毒素B1及其內標在串聯質譜上的檢測參數見表2，黃曲霉毒素B1及其內標基質標準溶液的總離子流色譜圖見圖1。

2.2 方法線性范圍和檢出限

在1.2.3儀器條件下，根據1.2.1配制的系列標準工作液：1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、6 ng·mL-1、8 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1進樣分析；工作曲線橫坐標為目標物質量濃度C（ng·mL-1）；工作曲線縱坐標為黃曲霉毒素B1峰面積與內標峰面積之比。圖2為黃曲霉毒素B1標準曲線所擬合的線性方程。由圖2可知該檢測方法在1～20 ng·mL-1的質量濃度內線性關系良好，相關系數R2為0.999 3。

2.3 方法的準確度和精密度

在花生油空白基質中分別加入3個水平的黃曲霉毒素B1標準品，混勻1 min，使花生油空白基質與所加入的標準品充分接觸后，加入200 μL濃度為0.05 μg·mL-1的黃曲霉毒素B1內標液，按1.2.2中的方法充分提取和凈化后檢測。每個進行6次平行實驗，計算其平均回收率和相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以考察方法的準確度和精確度，結果見表3。

由表3可知，在不同加標水平下，黃曲霉毒素B1的回收率在94.1%～107.4%，相對偏差（RSD）為5.6%～9.3%，回收率滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）食品理化檢驗中回收率要求即加標量小于0.1 mg·kg-1時回收率為60%～120%，相對標準偏差小于15%。表明該方法的回收率和精密度滿足花生油中黃曲霉毒素B1殘留檢測的要求。

2.4 質控樣測定

將所購質控樣采用該方法進行測定，測定結果為13.12 μg·kg-1，質控樣質控值為（12.44±1.38）μg·kg-1，測定值在質控值范圍內，表明該方法對花生油中黃曲霉毒素B1陽性樣品的測定具有較高的準確性，適用于實驗室中花生油中黃曲霉毒素B1的準確定量分析。

3 結論

本研究建立了花生油中黃曲霉毒素B1的LC-MS/MS測定方法，樣品前處理采用免疫親和柱技術，該方法無需進行衍生，簡便快捷、靈敏度高，特異性強、準確度和精密度均滿足定量分析的要求。在1～

20 ng·mL-1線性內呈良好線性關系（R2為0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加標水平下，回收率在94.1%～107.4%，相對標準偏差（n=6）為5.6%～9.3%，采用該方法測定花生油中黃曲霉毒素質控樣，檢測結果在質控樣質控值范圍內。因此，該方法可用于花生油中黃曲霉毒素B1的快速檢測。

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