1株椰毒假單胞菌酵米面亞種在濕米粉基質中的產毒情況和酸度分析

嚴瓊英, 李樂詩, 孫鈺涵, 林澤宇, 謝光宗, 鄒渝豐, 羅爾倫, 陳 晶

(深圳市計量質量檢測研究院,深圳 518131)

椰毒假單胞菌酵米面亞種(Pseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentans),是唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(B.gladioli)的一個病原型,能導致人類食物中毒[1]。椰毒假單胞菌酵米面亞種引起的食物中毒涉及食品種類較多,主要包括谷類發酵制品、變質銀耳和薯類制品等[2]。研究發現椰毒假單胞菌酵米面亞種的代謝產物米酵菌酸(bongkrekicacid, BA) 是一種具有較強生物活性的毒素,是該菌引起食物中毒和死亡的主要原因,被污染的食物進入人體后可引起神經系統、消化系統及泌尿系統的損傷,臨床癥狀表現為惡心、嘔吐、腹脹、腹痛等,嚴重者出現黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、血尿、血便等肝腦腎實質性器官損害癥狀[3-5]。米酵菌酸食物中毒是一種病死率較高的細菌性食源性疾病,流行于印度尼西亞和我國東北、西南等部分地區[6,7]。近年來,我國發生過多起因食用含有米酵菌酸的食品導致中毒死亡的事件[8-10]。

米粉是我國南方地區的一種傳統食品,尤其是廣東、廣西、湖南、湖北、云南、貴州、江西等省,人們習慣將米粉當做早餐主食,根據地區的不同,米粉又稱米線和濕米粉,在廣東一帶稱作濕米粉[11-13]。王海燕等[14]在廣東省首起米粉引起米酵菌酸食物中毒的樣品中發現濕米粉生產環節的廢渣、原料及成品均未檢出唐菖蒲伯克霍爾德菌產毒菌株,而流通及消費環節的濕米粉(多為散裝)檢出了唐菖蒲伯克霍爾德菌產毒菌株,并且流行病學調查確定米粉為高危暴露食品。多年來由椰毒假單胞菌酵米面亞種引起的中毒食物基本為發酵的谷類制品和長時間高溫泡發的變質銀耳等,但這次中毒事件中的濕米粉生產并沒有發酵過程,其中椰毒假單胞菌酵米面亞種的產毒條件并不清楚,為濕米粉安全生產和管理帶來困難。

酸度是衡量米粉口感的重要指標之一。食品中有機酸含量的多少,直接影響食品的風味、色澤、穩定性和品質的高低。研究發現,鮮濕米粉的酸度隨儲藏溫度的升高而升高,但4 ℃下儲存的樣品酸度無明顯變化[15,16]。可能是微生物利用米粉內的碳水化合物代謝產酸,米粉的酸度升高,而4 ℃的低溫環境對微生物的代謝活動起到了抑制作用,酸度無明顯變化[17]。BA的分子式為 C28H38O7, 是含有3 分子游離羧基的長鏈不飽和脂肪酸[18],目前還鮮有相關報道米酵菌酸是否會影響濕米粉酸度變化。

以市售散裝濕米粉作為實驗研究基質,分別接種不同初始濃度的椰毒假單胞菌酵米面亞種菌液,模擬濕米粉被菌株污染,經過不同溫度和時間培養后,測定濕米粉中米酵菌酸的濃度和酸度,從而了解椰毒假單胞菌酵米面亞種在濕米粉基質中的產毒條件,以及濕米粉酸度變化情況,為流通及消費環節的濕粉類食品儲存條件提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

椰毒假單胞菌酵米面亞種(本實驗室編號為83756),為實驗室按GB 4789.29—2020分離的,經VITEK 2 Compact生化鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德菌,經產毒培養后采用GB 5009.189—2016標準方法檢出米酵菌酸。

1.1.2 主要儀器與試劑

1.1.2.1 主要儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀,SHP-250型生化培養箱,HYC-390型冷藏箱,INE600型電熱恒溫培養箱,Densimat型比濁儀,BSA6202S百分之一電子天平。

1.1.2.2 主要試劑

血瓊脂平板;濕米粉;米酵菌酸標準品,純度96.9%,濃度1 mg/mL;甲醇和乙腈,HPLC 級;甲酸,HPLC 級;氨水,分析純;色譜柱,Agilent TC C18 4.6 mm×250 mm;超純水,18.2 MΩ·cm,實驗室Milli-Q 自制;1.0 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液。

1.2 方法

1.2.1 實驗用菌株培養物制備

將椰毒假單胞菌酵米面亞種83756株接種于血平板37 ℃培養24 h。

1.2.2 濕米粉模擬污染實驗

挑取1.2.1血平板培養物制備0.5麥氏濁度的菌懸液,經10倍系列稀釋獲得102、104、106CFU/mL數量級的低、中、高濃度菌液作為初始污染菌液量,分別用低濃度菌液、中濃度菌液、高濃度菌液代表102、104、106CFU/mL數量級的菌液。

稱取新鮮購買的濕米粉20 g至50 mL無菌離心管中,取低濃度菌液2 mL,在濕米粉的上、中、下層各取3個點,共9個點,每個點均勻加入約222 μL菌液,充分振蕩搖勻,盡量使濕米粉均勻接觸菌液。同樣方式,用中、高濃度菌液污染濕米粉,共獲得111瓶染菌濕米粉樣品,做好標記。

將經處理的108瓶濕米粉樣品分別放置于不同溫度(4、26、36 ℃)下培養,另3瓶未經培養處理,直接測定BA濃度和酸度。同時用加滅菌生理鹽水的濕米粉作為陰性對照。

每12 h(培養12、24、36、48、60、72 h)取出不同培養溫度和染菌量的濕米粉樣品各1瓶,每瓶分別參照GB 5009.189—2016《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》和GB5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》中淀粉及其衍生物的食品類別進行BA濃度和酸度檢測。

2 結果及分析

2.1 濕米粉的產毒情況

2.1.1 4 ℃培養染菌濕米粉的產毒情況

低、中、高3個不同初始濃度菌液污染濕米粉,放置于4 ℃培養72 h,在5個時間點分別取樣檢測,均未檢出BA。

2.1.2 26 ℃培養染菌濕米粉的產毒情況

3個不同初始濃度菌液污染濕米粉后放置于26 ℃培養,BA的檢出時間各不相同,如圖1所示。污染了低濃度菌液的濕米粉,在36 h時間點被檢測到BA,質量分數為3.88 μg/kg;污染了中濃度菌液的濕米粉,在24 h即可被檢測到BA,質量分數為13 μg/kg;污染了高濃度菌液的濕米粉,在12 h就可被檢測到BA,質量分數為0.98 μg/Kg。低濃度菌液污染濕米粉產生的米酵菌酸,72 h內濃度基本無變化,中濃度和高濃度菌液污染濕米粉產生的米酵菌酸,72 h內變化明顯,呈上升趨勢。污染的菌液濃度越高,變化越明顯。

圖1 26 ℃培養BA濃度變化

2.1.3 36 ℃培養污染濕米粉的產毒情況

3個不同初始菌液污染濕米粉后放置于恒溫培養箱,72 h內36 ℃培養BA的檢出情況如圖2。低濃度初始菌液污染濕米粉產生BA的時間較26 ℃培養提前12 h,即24 h可檢測到BA質量分數為1.15 μg/kg;中濃度初始菌液污染濕米粉的開始產毒時間仍為24 h,BA質量分數提高至378 μg/kg;高濃度初始菌液污染濕米粉的培養12 h的BA質量分數也較26 ℃提高數百倍,達490 μg/kg。36 ℃培養,3個不同濃度初始菌液污染濕米粉各時間段的BA產量均大于26 ℃培養下的產量。BA整體濃度變化趨勢與26 ℃培養的基本一致。

圖2 36 ℃培養BA濃度變化

2.2 不同溫度點、不同初始菌液濃度處理的濕米粉酸度變化情況

不同初始濃度菌液污染的濕米粉,經過不同溫度培養后,感官檢查發現濕米粉無明顯異味,其酸度變化見圖3、圖4和圖5。在不同的處理方式下,低、中、高濃度污染濕米粉樣品的酸度變化不大,且數值較低。酸度變化不大的原因分析：染菌培養后濕米粉中米酵菌酸質量分數最高時為6 010 μg/kg,而酸度對應的是10 g樣品消耗的0.1 mol/L NaOH體積,10 g樣品中米酵菌酸含量只有60 μg,換算成物質的量較小,所以樣品中的米酵菌酸對酸度的結果基本沒影響,3個初始菌液濃度各時間段的酸度結果與生理鹽水基本一致的;可能米酵菌酸的產生抑制了濕米粉中其他腐敗菌的生長,導致酸度基本沒變化。

圖3 低濃度菌量污染濕米粉在4、26、36 ℃溫度培養的酸度變化

圖4 中濃度菌量污染濕米粉在4、26、36 ℃溫度培養的酸度變化

圖5 高濃度菌量污染濕米粉在4、26、36 ℃溫度培養的酸度變化

3 結論

濕米粉污染椰毒假單胞菌酵米面亞種的實驗數據表明,接種了椰毒假單胞菌酵米面亞種菌液的濕米粉培養后,不同初始菌液濃度的濕米粉樣品產生BA的濃度受到培養溫度的影響最為明顯。培養溫度為4 ℃時,污染了3個不同初始濃度菌液的濕米粉均未檢出BA。因此控制樣品的存放溫度為4 ℃,可有效防止BA的產生。26、36 ℃培養,中、高濃度菌液污染的濕米粉產生的BA濃度隨著培養時間的延長而升高,且染菌濃度越高,濕米粉中BA被檢出的時間越早,檢出量越高。菌液污染濃度低(102CFU/mL),雖然在26、36 ℃培養會產生米酵菌酸但是濃度低;當菌液為中等污染濃度時(104CFU/mL),BA濃度會在24～48 h內成數倍增加,與培養時間呈正相關。樣品中BA的最高質量分數達到6 010 μg/kg,這樣的高含量BA可造成嚴重的食物中毒甚至引發人員死亡。菌液達到高污染水平時(106CFU/mL),染菌濕米粉中BA的產生規律與中濃度初始濃度菌液(104CFU/mL)污染樣品一致,但產毒量更大。實驗過程中,污染濕米粉的米酵菌酸質量分數最高為6 010 μg/kg,但酸度變化不大,樣品感官無明顯異味。初步判斷由于米酵菌酸的大量產生,抑制了其他產酸為主的腐敗菌生長,因此實驗周期內污染濕米粉的酸度變化很小。建議濕米粉經營企業不僅要確保鮮濕粉銷售過程的全程冷鏈,還要加強鮮濕粉的保質期管理,尤其在冷鏈措施不到位的情況下,產品從出廠到銷售不宜超過1 d,通過標簽、標識的方式提示消費者需要在采購當天全部食用。