油莎豆水溶性糖提取工藝及生物轉化低聚果糖的研究

李晨飛, 閆曉俠, 董舒月, 刁夢雪, 盧笑雨, 于亞莉, 張鐵華

(吉林大學食品科學與工程學院,長春 130062)

油莎豆(Cyperusesculeutus,CE)作為綠色健康的多用途經濟型油料作物,我國農戶對其種植熱情逐年高漲,油莎豆成為一種新型待開發食品原料[1-3]。隨著油莎豆油的不斷開發提取,大量的脫脂殘留物副產品應運而生。目前,副產品主要用于動物飼料或直接被丟棄,是一種資源浪費和環境污染現象[4,5]。油莎豆碳水化合物含量豐富,陳星等[6]分析油莎豆成分,其中糖的質量分數為23.35%,Svitlana等[7]研究發現油莎豆塊莖中碳水化合物只有蔗糖。

低聚果糖由于其雙歧特性以及生物功能特性已被歸類為益生元,是一種由酶促過程產生的低聚糖混合物[8,9]。低聚果糖按其結構可分為葡萄糖-果糖(GFn)型和果糖-果糖(Fn)型[10]。一般來說,Fn型FOSs主要是通過內切菊粉酶水解菊粉得到,而GFn型FOSs可以通過β-呋喃果糖苷酶或果糖基轉移酶的轉果糖基化反應,以蔗糖為底物得到[11]。果糖基轉移酶催化果酰基向蔗糖分子或低聚果糖轉移,果酰基鏈逐漸增長[12]。使用純蔗糖作為底物來生產低聚果糖,對于牲畜飼料的應用,使用低成本的蔗糖源更為經濟[11]。Khatun等[11]利用新型普魯蘭短梗霉從蔗糖和糖蜜中高效生產低聚果糖。Sheila等[13]從一種新的天然原料甜菊廢渣中提取菊粉和低聚果糖。低聚果糖由于其較低甜度、低致癌性、低熱量值、低血糖指數和促進雙歧桿菌增殖的營養和健康相關特性,越來越多地被食品工業使用[14]。李瑤等[15]通過建立小鼠肥胖模型,并進行低聚果糖干預,結果顯示低聚果糖可以一定程度上預防和控制肥胖。

超聲波輔助提取技術基于其“空化效應”促進可溶性成分溶出[16],主要是通過提高現有過程的反應速度或引發新的反應[17]。膜分離技術是一種新型純化技術,具備環境友好、分離效率高、成本低、操作簡便等優點,是純化多糖的理想選擇[18,19]。

研究利用油莎豆粕中豐富的蔗糖為原料合成益生元低聚果糖,將油莎豆脫脂后副產物開發利用創新得到了高價值低聚糖,為油莎豆粕的開發利用提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆粕、果糖基轉移酶(5 000 U/mL)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型);其他常用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

高速多功能粉碎機,超聲波破碎儀,SYWF-50水浴恒溫振蕩器,AvantiJ-E離心機,隔膜真空泵、微孔過濾膜(水系),Vivaflow 200即用型切向流膜包,BioTek Synergy HT多功能酶標儀,DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,冷凍干燥機,S6000型高效液相色譜儀,ELSD-UM5800蒸發光散射檢測器。

1.3 方法

1.3.1 水溶性糖制備工藝流程

將油莎豆粕粉碎,加入10倍質量冷水,超聲,水浴恒溫浸提得到油莎豆粕水溶性糖。

1.3.1.1 單因素實驗

稱取高速粉碎后的油莎豆粕粉末1 g,設定料液比1∶10,搖床速度100 r/min為固定條件,提取時間為1 h,提取溫度為70 ℃,分別研究超聲時間(0～30 min)對水溶性糖提取率的影響。設定超聲時間為10 min,提取溫度為70 ℃,分別研究提取時間(1～6 h)對水溶性糖提取率的影響。設定超聲時間為10 min,提取時間為3 h,研究提取溫度(40～90 ℃)對水溶性糖提取率的影響。

1.3.1.2 響應面實驗

通過初步實驗確定了提取率的最佳提取點范圍,響應面實驗設計用于評估3個因素的影響以及優化提取工藝參數,以水溶性糖提取率為響應值,以超聲時間、提取時間、提取溫度為3個單因素進行響應面優化設計,響應面設計因素與水平見表1,其中-1、0、1分別代表自變量的低、中、高3個水平。采用Design-Expert軟件,應用Box-Behnken原理進行3因素3水平實驗設計(共17 組),從而確定提取的最優條件。

表1 響應面設計因素與水平

1.3.2 水溶性糖提取率測定[20]

1.3.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品2 mg,蒸餾水溶解,20 mL容量瓶定容,得100 μg/mL的葡萄糖標準溶液。

1.3.2.2 葡萄糖標準曲線的制備

蒸餾水作為空白對照,梯度吸取0、40、80、120、160、200 μL對照品溶液于2 mL離心管中,蒸餾水補至200 μL。依次加入200 μL質量分數5%苯酚溶液、700 μL濃硫酸后,迅速振蕩搖勻,室溫反應20 min后,分別吸取各梯度反應液200 μL加入96孔板中,每個濃度3個孔,采用酶標儀測定490 nm下吸光值,橫坐標為葡萄糖濃度,縱坐標為OD490 nm值,得回歸方程Y=0.006 2x+0.092 8,R2=0.998 8。葡萄糖標準曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.2.3 水溶性糖提取率

將水溶性糖提取液稀釋到一定濃度,按照標準曲線步驟操作,根據公式計算水溶性糖提取率：

式中：C為水溶性糖質量濃度/μg/mL;V為提取液體積/mL;m為油莎豆粕粉質量/μg。

1.3.3 水溶性糖的純化工藝

通過最優提取工藝得到油莎豆粕水溶性粗糖液,采用等電點沉淀法與膜分離技術相結合去除粗糖液中的蛋白質。

1.3.3.1 等電點沉淀法

滴加1 mol/L的鹽酸將油莎豆粕粗糖液pH調整為4和5,常溫放置4 h,12 000 r/min離心10 min,0.45 μm膜進行超濾,除去溶液中的絮狀懸浮雜質,得到初步純化后的水溶性糖。

1.3.3.2 等電點沉淀法-膜分離技術聯用

滴加1 mol/L的鹽酸將油莎豆粕粗糖液pH調整為4和5,常溫放置4 h,12 000 r/min離心10 min,0.45 μm膜進行超濾后10 ku膜進行膜過濾,得到純化后的水溶性糖。

1.3.4 蛋白含量測定

采用BCA法測定蛋白含量。

1.3.4.1 蛋白標準品的制備

蒸餾水溶解牛血清白蛋白,制備0.5 mg/mL蛋白標準品,儲藏于-20 ℃。

1.3.4.2 蛋白濃度檢測

梯度吸取不同體積的0.5 mg/mL蛋白標準品于96孔板中,蒸餾水補足到20 μL,使蛋白質量濃度為0～0.5 mg/mL,樣品稀釋至一定倍數取20 μL加入孔中,各孔再加入200 μL BCA工作液60 ℃放置30 min,在562 nm處檢測吸光值,對應標準曲線線性回歸方程和稀釋倍數確定蛋白濃度。

1.3.5 蛋白脫除率、糖保留率計算公式

蛋白脫除率、糖保留率的計算參考了郭思維等[21]的方法：

式中：A1為脫蛋白前蛋白吸光度;A2為脫蛋白后蛋白吸光度;B1為脫蛋白前糖吸光度;B2為脫蛋白后糖吸光度。

1.3.6 低聚果糖制備工藝

將除蛋白后的水溶性糖液進行旋轉蒸發調整固形物質量分數為5%～7%后,添加不同比例的果糖基轉移酶,在恒溫水浴搖床中65 ℃,100 r/min 轉化12 h,于85 ℃水浴條件下滅酶15 min,冷凍干燥即得低聚果糖粉末。

1.3.7 高效液相色譜檢測

色譜柱：COSMOSIL Sugar-D(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相 ∶乙腈水=75 ∶25;流速：0.5 mL/min;柱溫：35 ℃;蒸發光散射檢測器漂移管溫度：75 ℃,載氣流速：2.5 mL/min。

1.3.8 低聚果糖含量計算公式

低聚果糖(FOS)含量=蔗果三糖(GF2)含量+蔗果四糖(GF3)含量+蔗果五糖(GF4)含量[22]。

1.4 數據統計分析

采取SPSS 19統計軟件進行數據的處理與分析,采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化分析,使用Origin 9.0和GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

提取因素對提取率的影響如圖2所示,在超聲處理時間延長至15 min的過程中提取率明顯升高,超聲波的同時作用促進了溶劑的水化破碎反應[23],可以較快地使油莎豆粕中的水溶性糖溶出,但是隨著超聲處理時間的繼續加長,提取率提高趨于平緩,此時水溶性糖已經基本溶于水中,考慮到提高效率及節約能源,選取15 min為單因素實驗最理想的超聲時間。

圖2 提取因素對提取率的影響

從圖2可以看出,隨著提取時間的延長,提取率達到最大值后,提取時間超過3 h,提取率開始逐漸輕微下降。適當的提取時間會引起多糖的增溶作用,而過長的提取時間造成了水溶性糖的不穩定性[24]。因此選取3 h為單因素最理想的提取時間。

圖2可見,當溫度從40 ℃升高至70 ℃,提取率也明顯升高,水溶性糖提取率到達峰值,當溫度從70 ℃升高至90 ℃時,這一階段在穩定的基礎上略有下降。提取溫度升高伴隨著糖分子的劇烈運動,根據平衡濃度理論,升高溫度可以加速糖的轉移,因此升高提取溫度有利于增加提取率[25,26]。但是,過高的溫度也會導致一些只能在低溫下才能活化的熱敏多糖變性[26],還可能會導致多糖結構的破壞[24],因此,選擇70 ℃為提取溫度進行下一步實驗。

2.2 響應面實驗結果

2.2.1 響應面實驗結果及方差分析

水溶性糖提取的響應面實驗方差分析見表2。利用Design-Exepert 8.0.6軟件,對響應值和各個因素進行二次多元回歸擬合,得該模型對應的回歸方程。建立的數學模型為：Y=-145.22+3.41A+39.01B+2.95C+0.22AB+0.02AC-0.21BC-0.18A2-4.39B2-0.02C2(R2=0.939 5)。

表2 水溶性糖提取的響應面試驗方差分析

2.2.2 回歸模型的方差分析

表3 回歸模型方差分析

由表3可以看出,在一次項的預測中,3個單因素對水溶性糖提取率的影響(P<0.05)均達到顯著水平;影響大小依次遞減為超聲時間、提取溫度、提取時間。在二次項的預測中,超聲時間和提取時間都達到了極顯著水平(P<0.01),提取溫度未達到顯著水平。在交互項中,提取溫度與提取時間的交互作用影響較顯著,達到了顯著水平(P<0.05),其他2組交互項均未達到顯著水平。

2.2.3 模擬驗證實驗

Design-Expert 8.0.6軟件對響應面實驗結果進行分析,理想最優工藝參數：超聲時間16.27 min、提取時間3.10 h、提取溫度74.51 ℃,在此條件下,預測提取率為52.88%。考慮到實際操作、能耗及效率等因素,將理論最優條件調整為：超聲時間為16 min、提取溫度為75 ℃、提取時間為3 h。在調整后優化條件下進行3次平行實驗,驗證調整后的提取率,得到提取率為(52.61±0.51)%,差異不顯著。

2.2.4 油莎豆粕水溶性糖的純化工藝

不同方法除蛋白效果如圖3所示,采用等電點沉淀法處理過后的水溶性糖液進行超濾后膜分離處理時效率更高。膜分離技術顯著提高了蛋白質清除率,達到了更好的脫除蛋白效果。2種等電點沉淀法與膜分離技術聯用的蛋白質清除率以及糖保留率差距不大,但是考慮后續實驗中果糖基轉移酶作用的最適pH為5。在保證實驗效果的同時,出于精簡實驗步驟,提高實驗效率,節約能源的綜合考慮,油莎豆粕水溶性糖的純化工藝采用實驗組E法,在此基礎上,繼續后續實驗。

注：A為未處理組;B為等電點法pH=4;C為等電點法pH=5;D為等電點法pH=4-膜分離技術;E為等電點法pH=5-膜分離技術。圖3 不同方法除蛋白效果

2.2.5 生物轉化低聚果糖工藝優化

低聚果糖組分含量見表4。油莎豆粕水溶性糖中蔗糖質量分數高達97.80%,果糖與葡萄糖質量分數分別為0.64%以及1.40%,證明了油莎豆粕可以作為低成本的蔗糖源;隨著果糖基轉移酶添加比例的不斷增大,蔗糖含量顯著減少,果糖和葡萄糖持續增多,GF2和GF3含量呈現先升高后降低的趨勢,GF4在酶比例為1∶100時才被檢測到,FOS含量總體先升高后降低。當底物濃度遠遠高于酶的濃度時,酶的反應速度隨酶濃度增加而增加,果糖基轉移酶作用于蔗糖分子中的葡萄糖和果糖之間的β(2-1)糖苷鍵,使游離的果糖基連接到另一個蔗糖分子的果糖殘基上形成GF2,并逐步形成GF3[27],但當底物與酶的活力中心結合飽和后,低聚果糖含量就不再增加,酶絕對過量時,GF2的一個果糖基會被轉移到另一個GF2上生成蔗糖和GF3[28],說明當酶比例為1∶100時酶絕對過量。當酶比例為1∶1 000時,低聚果糖質量分數達到30.25%,主要為蔗果三糖與蔗果四糖,分別為27.53%和2.72%,此時轉化率最高,FOS含量最高。

表4 低聚果糖組分質量分數/%

3 結論

以油莎豆粕為原料,浸提油莎豆粕中豐富的糖類,運用超聲波輔助熱水提取技術,建立了3種因素相互作用的響應面模型,得到了提取油莎豆粕水溶性糖的最優工藝;脫除蛋白進一步提高水溶性糖純度,比較5種純化工藝,確定了等電點沉淀法與膜分離技術聯用脫除蛋白工藝,達到了有效脫除蛋白和保留糖含量的效果,為有效脫除蛋白提供了一條新思路;高效液相色譜檢測發現,油莎豆粕中蔗糖含量豐富,可以作為低聚果糖生產低成本的蔗糖源,采用果糖基轉移酶轉化蔗糖為低聚果糖,合理有效地回收利用了農副產品資源,具有良好的工業應用前景。