真空浸漬輔助BTH-Ca2+復(fù)合處理對甘薯采后愈傷能力的影響

宣紅霞, 管玉格, 鄭 劍, 龐林江, 陸國權(quán), 成紀(jì)予

(浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院,杭州 311300)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam]體積大、水分高,皮薄肉嫩,在采收和流通環(huán)節(jié)極易發(fā)生割傷、碰傷、擦傷等機(jī)械損傷。損傷甘薯表面的傷口不僅加速水分蒸發(fā),而且是病原菌入侵的最佳通道。據(jù)統(tǒng)計(jì),每年大概有15%的甘薯因儲藏不當(dāng)而腐爛,其中因機(jī)械損傷而導(dǎo)致病原菌侵入引起的腐爛占總損失50%以上[1]。甘薯受到損傷后,會激發(fā)體內(nèi)自我防御系統(tǒng)的響應(yīng),啟動自愈功能,在傷口處形成愈傷組織,有效地防止水分流失和病菌入侵[2-4]。甘薯傷口自愈時間一般需要2～3周,在長時間愈傷過程中,甘薯的品質(zhì)易受外界因素影響而劣變。目前,可通過熱處理或化學(xué)藥劑處理加快甘薯愈傷。熱處理愈傷如熱空氣、熱水和微波處理等有利于甘薯傷口周皮的形成[5,6],但處理時需要有相應(yīng)加熱設(shè)施,實(shí)際應(yīng)用時存在操作不便、能耗大、不易受熱均勻等問題。適宜濃度的化學(xué)藥劑如脫落酸(ABA)[1]、苯丙噻重氮(BTH)[7]、一氧化氮(NO)[8]等均能加速甘薯的愈傷,有處理簡便、設(shè)備投資少等優(yōu)點(diǎn),但是僅使用單一藥劑容易存在效果不明顯、不穩(wěn)定等問題,因此,開發(fā)更高效的復(fù)合藥劑將有更好的推廣前景。

BTH為水楊酸(SA)類似物,是一種人工合成的植物誘導(dǎo)抗病劑,安全性高,不管采前還是采后使用對果蔬病害的防治效果良好[9,10]。BTH誘導(dǎo)抗病性的增強(qiáng)與其促進(jìn)植物體內(nèi)木質(zhì)素含量的增加有關(guān)[11]。它通過提高PAL、C4H、4CL、CAD等苯丙烷代謝關(guān)鍵酶活性,促進(jìn)酚類、類黃酮、木質(zhì)素等產(chǎn)物的合成和累積,起到加快甘薯[7]、馬鈴薯[9]、梨[12]、甜瓜[13]等采后愈傷進(jìn)程的作用。鈣在植物細(xì)胞壁組成、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的維持以及提高植物抗性方面發(fā)揮著重要的作用[14]。外源Ca2+處理也可激發(fā)苯丙烷代謝,增加木質(zhì)素含量,提高愈傷效率和抗病能力[15]。研究還表明,Ca2+對外源誘抗劑誘導(dǎo)植物體內(nèi)木質(zhì)素含量的合成調(diào)控具有增強(qiáng)作用[16]。目前,將BTH-Ca2+復(fù)合處理應(yīng)用于促進(jìn)甘薯采后愈傷的研究鮮有報(bào)道。

真空浸漬是真空處理與傳統(tǒng)浸漬相結(jié)合的一種高效技術(shù),具有提升浸漬效率、增強(qiáng)浸漬效果的作用[17]。“心香”甘薯食味細(xì)膩可口,品種優(yōu)良,但薯皮很薄,極其容易受損傷。結(jié)合真空浸漬技術(shù),以“心香”甘薯為研究對象,進(jìn)行人工機(jī)械損傷,以木質(zhì)素含量為指標(biāo),通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),建立可信的數(shù)學(xué)模型,獲得BTH-Ca2+復(fù)合處理對甘薯愈傷的最佳工藝參數(shù),探究最佳處理?xiàng)l件下甘薯愈傷部位木質(zhì)素合成及其相關(guān)酶活性之間的關(guān)系,以期為甘薯采后的快速愈傷提供一種可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯品種：心香,由浙江農(nóng)林大學(xué)薯類作物研究所合作基地提供。挑選性狀一致、大小均勻、無機(jī)械損傷和病害的甘薯為實(shí)驗(yàn)材料。

試劑：BTH、乳酸鈣、次氯酸鈉、硼酸、硼砂、L-苯丙氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、β-巰基乙醇、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫(H2O2)、乙酸、乙酸鈉、Triton X-100、聚乙二醇6000(PEG 6000)、高氯酸、鹽酸、氯化鎂、維生素C(VC)、亮抑酶肽(Leupeptin)、甘油、苯甲基磺酰氟(PMSF)、氧化型輔酶II二鈉(NADPNa2)、D-葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽(G6-pNa2)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、反式肉桂酸、煙酰胺腺嘌呤雙核苷酸磷酸鹽(NADP)、輔酶A、p-香豆酸、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)等均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

HWS-250FT 智能低溫冷藏箱,UNICO 2802紫外分光光度計(jì),DGG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,SIGMA 3K15離心機(jī),TH-200Q超聲波清洗器,HH-6恒溫水浴鍋,IKA A11 basic研磨機(jī),SHB-IIIA真空泵。

1.3 方法

1.3.1 甘薯的損傷處理

將新鮮甘薯洗凈,用體積分?jǐn)?shù)1%～2%次氯酸鈉溶液浸泡3 min消毒,用蒸餾水沖洗后晾干。用已消毒不銹鋼刮皮刀在甘薯表面赤道部位削出3個長×寬×深約為20 mm×10 mm×2 mm的傷口。

1.3.2 甘薯的愈傷處理

將人工損傷后甘薯完全浸入溶液中(料液比1∶2,m/V),再將其置于真空浸漬裝置內(nèi)進(jìn)行愈傷處理,見圖1。浸漬處理好的甘薯取出自然風(fēng)干,置于室溫(25 ℃)、相對濕度80%～85%的黑暗環(huán)境中進(jìn)行愈傷。

圖1 真空浸漬裝置

1.3.3 取樣

在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,根據(jù)木質(zhì)素的累積情況,在愈傷的0、1、2 d時分別取樣,每處理每次取樣甘薯10個,用已消毒不銹鋼小刀取甘薯傷口及傷口下2 mm厚的愈傷組織[18],快速液氮冷凍,使用研磨機(jī)研成粉末,密封保存于-80 ℃,待測。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

以木質(zhì)素含量為指標(biāo),分析不同的BTH濃度(0、50、100、150、200 mg/L)、乳酸鈣濃度(0、5、10、15、20、25 g/L)、真空度(5、10、15、20、25、30 kPa)和浸漬時間(2、4、6、8、10 min)對甘薯愈傷效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,從BTH濃度(A)、乳酸鈣濃度(B)、真空度(C)、真空時間(D)4個因素中,分別選取3個對甘薯愈傷效果影響較大的水平,以木質(zhì)素含量為響應(yīng)值,根據(jù) Box-behnken 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,確定響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案,并建立回歸方程進(jìn)行預(yù)測,影響因素與水平見表 1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.4 測定方法

1.4.1 木質(zhì)素含量

采用試劑盒檢測。稱取1.0 g樣品,在80 ℃下烘干至恒重,碾磨后過40目篩,然后按照試劑盒的說明進(jìn)行檢測。反應(yīng)結(jié)束后在280 nm處測定吸光值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以干質(zhì)量計(jì),單位為mg/g。

1.4.2 PAL活性

參考Wang等[7]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L pH 8.8硼酸緩沖液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)40 g/L PVP、濃度2 mmol/L EDTA和濃度5 mmol/L β-巰基乙醇)充分混勻,于4 ℃,12 000 × g離心30 min,收集上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為：3 mL 50 mmol/L pH 8.8硼酸緩沖液,加入0.5 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸,在37 ℃預(yù)保溫10 min,再加入0.5 mL酶液,混合后迅速在290 nm測初始吸光度,然后將反應(yīng)管置于37 ℃保溫60 min,加入0.1 mL 濃度6 mol/L鹽酸溶液終止反應(yīng),在290 nm測終止吸光度。以每小時吸光值變化0.01為1個活力單位(U),單位為U/g。

1.4.3 C4H活性

參考Jiang等[19]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,加入3 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的pH 8.9 50 mmol/L Tris-HCI緩沖液(含4 mmol/L MgCl2,15 mmol/L β-疏基乙醇,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15 % PVP,5 mmol/L VC,10%甘油,10 μmol/L Leupeptin和1 mmol/L PMSF),在冰浴條件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g離心20 min,收集上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為：300 μL濃度2 mmol/L NADPNa2,100 μL酶液,300 μL 2 mmol/L G6-pNa2和300 μL濃度2 mmol/L 反式肉桂酸,混勻后25 ℃水浴30 min,結(jié)束后在340 nm測吸光度。以每分鐘吸光值變化0.01為1個活力單位(U),表示為U/g。

1.4.4 4CL活性

參考Jiang等[19]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,加入5 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的pH 8.9濃度50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(含4 mmol/L MgCl2,濃度15 mmol/L β-疏基乙醇,質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.15 % PVP,5 mmol/L VC,體積分?jǐn)?shù)10%甘油,10 μmol/L Leupeptin和1 mmol/L PMSF),在冰浴條件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g離心30 min,收集上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系為：0.15 mL 250 μmol/Lp-香豆酸、400 μL酶液、0.15 mL 50 μmol/L ATP、0.15 mL 15 μmol/L MgSO4、0.15 mL 1 μmol/L 輔酶A。在40 ℃下水浴10 min,取出后在333 nm處測定吸光度。以每分鐘吸光值變化0.01為一個活力單位(U),表示為U/g。

1.4.5 CAD活性

參考Jiang等[19]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,加入5 mL 4 ℃預(yù)冷的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.25含β-巰基乙醇15 mmol/L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%PEG 6000和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PVP),在冰浴條件下充分提取1 h,在4 ℃,12 500 r/min下離心25 min,收集上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：0.6 mL酶液和2.4 mL反應(yīng)液(1 mL 2 mmol/L NADP,1.4 mL 1 mmol/L反式肉桂酸),在37 ℃下水浴30 min,然后加入200 μL 1 mol/L HCl終止反應(yīng),之后在340 nm測定吸光度。以每分鐘吸光值變化0.01為1個活力單位(U),表示為U/g。

1.4.6 POD活性

參考Wang等[7]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取1.0 g樣品,加入5.0 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液(含1 mmol PEG 6000、4% PVP、1% Triton X-100),在冰浴條件下充分提取1 h,于4 ℃,12 000 × g離心30 min,收集上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系：3 mL 25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液,0.5 mL酶液、200 μL 0.5 mol/L H2O2溶液迅速混合啟動反應(yīng),在波長470 nm測吸光度,以每分鐘吸光值變化0.01為1個活力單位(U),表示為U/g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)≥3次,結(jié)果以平均值±SD表示;采用Design-expertV8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析;用SPSS 26進(jìn)行顯著性差異分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Dunken’s統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 BTH濃度對甘薯愈傷的影響

木質(zhì)素是甘薯愈傷組織的重要組成成分,與甘薯抗病性密切相關(guān),木質(zhì)素含量越高,其抗病性越好[20]。因此,外源處理通過促進(jìn)甘薯傷口部位木質(zhì)素的積累,可加速甘薯愈傷,增強(qiáng)其抗病性。由圖1可知,不同濃度BTH處理均可不同程度地促進(jìn)木質(zhì)素合成,隨著BTH濃度增加,甘薯傷口部位木質(zhì)素含量呈先上升后略微下降的趨勢,這可能是超過一定濃度時反而會降低甘薯傷口部位的可溶性糖含量[21],而糖類物質(zhì)不僅可以提供能量,也是合成木質(zhì)素的碳骨架[22],從而影響木質(zhì)素的積累。結(jié)果表明,質(zhì)量濃度100 mg/L BTH處理時,甘薯傷口部位木質(zhì)素生成量最多(P<0.05),更有利于甘薯愈傷。

2.1.2 Ca2+濃度對甘薯愈傷的影響

鈣處理可以誘導(dǎo)活性氧(ROS)積累,進(jìn)而積累更多的木質(zhì)素,提高植物體抵御病原菌的能力[23]。由圖2可知,不同Ca2+濃度處理之間甘薯傷口部位木質(zhì)素含量存在差異,隨著Ca2+濃度的增加,木質(zhì)素含量呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)Ca2+質(zhì)量濃度為15 g/L時,木質(zhì)素含量的增加幅度最大(P<0.05),隨著濃度繼續(xù)增加,木質(zhì)素含量反而降低,這可能是Ca2+過高濃度會改變甘薯傷口部位細(xì)胞質(zhì)鈣濃度,造成膜傷害,不利于合成木質(zhì)素[24]。可見,適宜的Ca2+濃度作用下才能更好促進(jìn)甘薯愈傷。

注：圖中不同小寫字母表示組間差異顯著 ( P<0.05)。圖2 BTH質(zhì)量濃度、乳酸鈣質(zhì)量濃度、真空度、真空時間對甘薯木質(zhì)素含量的影響

2.1.3 真空度對甘薯愈傷的影響

由圖2可知,隨著真空度的增加,甘薯木質(zhì)素含量呈先平緩上升后逐漸下降的趨勢。當(dāng)真空度在15 kPa時,木質(zhì)素的積累量達(dá)到最大值(P<0.05)。可見,在適當(dāng)?shù)恼婵斩认?有利于外源BTH-Ca2+復(fù)合處理溶液的滲入,快速誘導(dǎo)甘薯傷口的響應(yīng)機(jī)制,促進(jìn)木質(zhì)素的生物合成;但真空度過大,則會破壞細(xì)胞膜完整性,不利于細(xì)胞修復(fù)[25]。

2.1.4 真空時間對甘薯愈傷的影響

由圖2可知,隨著真空時間的增加,甘薯木質(zhì)素含量呈先上升后下降的變化趨勢。當(dāng)真空時間為6 min時,木質(zhì)素含量達(dá)到峰值;隨著時間繼續(xù)增加,木質(zhì)素含量無顯著性增加,時間過長反而略有降低(P>0.05),這可能是因?yàn)殚L時間的負(fù)壓會導(dǎo)致細(xì)胞壁和膜完整性的破壞[26]。結(jié)果表明,合適的真空時間有助于提高甘薯愈傷的效率。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化方案及結(jié)果如表2所示,通過多元回歸擬合,得到木質(zhì)素含量對BTH質(zhì)量濃度(A)、乳酸鈣質(zhì)量濃度(B)、真空度(C)和真空時間(D)的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=178.12+2.64A-1.49B+14.89C+2.8D-0.98AB-4.58AC+1.92AD-3.32BC+5.35BD+11.85CD-13.59A2-4.57B2-5.5C2-17.01D2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3可知,回歸模型在統(tǒng)計(jì)學(xué)上極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),R2=0.868 3,說明該模型擬合度良好,模型選擇合理。其中,變量C、CD、A2、C2和D2對木質(zhì)素含量的影響均極顯著(P<0.01),各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：真空度>真空時間>BTH濃度>乳酸鈣濃度。各因素兩兩之間交互作用明顯,總的來說,隨著BTH質(zhì)量濃度、乳酸鈣質(zhì)量濃度、真空度及真空時間增加,木質(zhì)素含量呈先上升后有略微下降趨勢,說明在適宜的條件下處理才能更好地促進(jìn)甘薯愈傷。

2.3 最優(yōu)處理參數(shù)的驗(yàn)證

結(jié)合二次回歸模型的分析結(jié)果,得到真空浸漬輔助BTH-Ca2+復(fù)合處理促進(jìn)甘薯愈傷的最佳處理參數(shù)為：BTH質(zhì)量濃度99.33 mg/L、乳酸鈣質(zhì)量濃度14.1 g/L、真空度15 kPa、真空時間6.76 min。考慮到實(shí)際操作的便利性,修正各參數(shù)為：BTH質(zhì)量濃度100 mg/L、乳酸鈣質(zhì)量濃度14.1 g/L、真空度15 kPa、浸漬時間為6.5 min,在此條件下進(jìn)行甘薯愈傷處理,木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為195.06 mg/g,比理論值高2%左右。說明所建模型可靠,優(yōu)化得到的處理?xiàng)l件可行。BTH-Ca2+復(fù)合處理下可加快木質(zhì)素積累,但是兩者復(fù)合處理的作用機(jī)制有待進(jìn)一步解析。

2.4 處理對木質(zhì)素合成及其相關(guān)酶活性的影響

木質(zhì)素是苯丙烷代謝途徑的代謝產(chǎn)物,能加強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度進(jìn)而提高對病原菌的抵御能力[27,28]。由圖3可知,受到機(jī)械損傷脅迫后,甘薯自身會激發(fā)防御響應(yīng),慢慢積累木質(zhì)素,開啟傷口自我愈合,這與馬鈴薯[29]、蘋果[30]、番茄[31]等受到機(jī)械傷害時的應(yīng)激反應(yīng)變化趨勢相一致。與對照組相比,經(jīng)BTH-Ca2+復(fù)合處理的甘薯傷口部位木質(zhì)素含量和PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性的上升幅度均有所增加,表明愈合進(jìn)程有所加快。愈傷2 d時,處理組木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照組增加了33.6%(P<0.05),4CL、CAD和POD活性分別比對照組提高了12.6%、23.2%和53.2%(P<0.05)。吳覺天[32]、梁偉等[33]的研究表明,馬鈴薯、南瓜采后愈傷效果的提高與增強(qiáng)受損部位苯丙烷代謝途徑有關(guān),本實(shí)驗(yàn)得到類似的研究結(jié)果。因此,BTH-Ca2+復(fù)合處理可以通過激活甘薯愈傷期間的苯丙烷代謝,促進(jìn)愈傷。

注：*表示組間存在顯著差異(P<0.05)。

2.5 處理后木質(zhì)素含量與相關(guān)酶活性的關(guān)系

已有研究表明,通過誘導(dǎo)調(diào)節(jié)苯丙烷代謝中PAL、C4H、4CL和CAD等關(guān)鍵酶的活性和基因表達(dá),可增加木質(zhì)素、酚類及其它抗菌物質(zhì)的合成,抑制病原菌的侵染[34,35]。由表4可知,經(jīng)BTH-Ca2+復(fù)合處理后,甘薯損傷部位的木質(zhì)素含量及其相關(guān)酶活性之間均呈正相關(guān),其中,木質(zhì)素含量與PAL、4CL、CAD和POD活性之間呈極顯著相關(guān)(P<0.01);PAL活性與CAD和POD活性呈極顯著相關(guān)(P<0.01),與4CL活性之間呈顯著相關(guān)(P<0.05);C4H活性與4CL和CAD活性之間呈顯著相關(guān)(P<0.05);4CL活性與CAD和POD活性之間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。根據(jù)相關(guān)性分析結(jié)果,進(jìn)一步推測本實(shí)驗(yàn)處理可以通過提升木質(zhì)素合成代謝關(guān)鍵酶的活性,促進(jìn)木質(zhì)素的積累,實(shí)現(xiàn)快速愈傷。

表4 木質(zhì)素含量和總酚含量以及相關(guān)酶活性的相關(guān)分析

3 結(jié)論

外源處理可以加快甘薯損傷部位的木質(zhì)素合成速率,提高愈傷能力。本實(shí)驗(yàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到真空浸漬輔助BTH-Ca2+復(fù)合處理促進(jìn)甘薯愈傷的工藝參數(shù),對提升甘薯采后的儲藏保鮮品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義和應(yīng)用價值。結(jié)果表明,促進(jìn)“心香”甘薯愈傷的最佳處理參數(shù)為：BTH質(zhì)量濃度100 mg/L、乳酸鈣質(zhì)量濃度14.1 g/L、真空度15 kPa、真空浸漬時間為6.5 min,在此條件下愈傷2 d,木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為195.06 mg/g,比對照組木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)高33.6%。同時,處理后的甘薯損傷部位苯丙烷代謝途徑中PAL、C4H、4CL、CAD和POD活性均有所增強(qiáng),與木質(zhì)素含量呈顯著的正相關(guān)性。可見,在本實(shí)驗(yàn)條件下,BTH-Ca2+復(fù)合處理通過激活苯丙烷代謝途徑的活性,加速了甘薯對機(jī)械脅迫的快速應(yīng)激反應(yīng),有利于木質(zhì)素的合成與積累,從而提高甘薯采后的愈傷能力。