千里香杜鵑提取物對赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲的防治作用

王旭東, 吳昊書, 王作亮, 李秋月, 王俊龍,2, 張 繼,2, 梁俊玉,2

(西北師范大學生命科學學院1,蘭州 730070)

(西北師范大學新農村發展研究院2,蘭州 730070)

赤擬谷盜Triboliumcastaneum和煙草甲Lasiodermaserricorne是2種倉儲害蟲,分布于世界各地。赤擬谷盜現已成為我國大型糧倉中的優勢害蟲種群,其食性廣,可危害谷物、油糧、食用菌、中藥材、動物性產品及加工產品等,從而造成嚴重的經濟損失[1]。煙草甲具有適應能力強、食性廣泛,主要危害儲存的谷物、香料和中藥材料等,也可危害儲存過程中的煙葉及卷煙制品,造成較為嚴重的經濟損失[2-4]。植物線蟲是引起我國農作物病害的重要病原物之一,是嚴重危及我國小麥、玉米、水稻、甘薯、馬鈴薯、大豆、蔬菜、花生、中草藥等糧食和經濟作物安全生產的重要病害[5]。馬鈴薯莖線蟲Ditylenchusdestructor作為植物線蟲的一種,寄主分布廣泛,可侵染危害包括馬鈴薯、甘薯、豌豆、花生和玉米等糧油作物[6,7]。

赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲的防控主要依賴于化學殺蟲劑,其長期使用使得害蟲產生耐藥性,而且使用后的藥劑殘留對食品安全、人類健康和生態環境產生了極大的影響[8-10]。因此,尋找綠色、安全和高效的新型殺蟲劑至關重要。近年來,因為許多植物次生代謝物具有觸殺、拒食、趨避、拒產卵和生長發育等生物活性,而且還具有高效、低毒、安全等優點,植物源提取物已成為新型綠色農藥開發的研究重點[11,12]。張紅建等[13]報道了麻瘋樹、山蒼子和山苦楝95%乙醇粗提物對赤擬谷盜表現出較強的驅避性和觸殺性。趙海剛等[14]報道了巴豆乙醇提取物、巴豆丙酮提取物、巴豆乙酸乙酯提取物等對煙草甲成蟲有較好的觸殺毒力。閆磊等[15]報道了銀杏甲醇提取物對馬鈴薯莖線蟲具有很高的毒殺活性。

千里香杜鵑Rhododendronthymifolium為杜鵑花科杜鵑花屬常綠直立小灌木, 高0.3～1.3 m。其生于海拔2 400～4 800 m的濕潤陰坡或半陰坡、林緣或高山灌叢中, 產于甘肅、青海、四川等地[16,17]。研究發現,千里香杜鵑揮發油及其單萜類化合物吉馬酮對赤擬谷盜、嗜卷書虱、煙草甲均有較強的毒殺活性[18,19]。千里香杜鵑中多種單萜類化合物也被報道具有殺蟲、殺菌、抗病毒活性[20,21]。目前對千里香杜鵑的抗蟲活性的研究報道多集中于其揮發油和揮發性成分單萜、二萜類化合物中,鮮有千里香杜鵑枝、葉粗提物對赤擬谷盜和煙草甲的觸殺、熏蒸活性研究,也鮮有千里香杜鵑對赤擬谷盜和煙草甲的拒食活性研究以及對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性研究。所以本實驗研究了千里香杜鵑枝、葉經不同溶劑(石油醚、甲醇、95%乙醇)提取得到的物質對赤擬谷盜和煙草甲的觸殺、熏蒸和拒食作用以及對馬鈴薯莖線蟲的毒殺作用,初步篩選出對赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲具有較好生物活性的提取物和有效抗蟲活性的部位,為千里香杜鵑防治赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲以及發展糧油作物生態種植和綠色倉儲提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

千里香杜鵑樣本于2021年8月采自甘肅省天祝縣石門鎮(東經36°58′58″,北緯102°54′04″,海拔2 765 m)。植物學名經西北師范大學生命科學學院梁俊玉副教授鑒定。樣本自然陰干,存放于實驗室。

1.2 供試蟲源

1.2.1 赤擬谷盜和煙草甲

將赤擬谷盜和煙草甲飼養在容積為0.5 L的玻璃瓶中,以10 ∶1質量比混合的小麥粉與酵母粉進行飼養。培養溫度28～30 ℃,相對濕度為70%～80%。實驗昆蟲(試蟲)為羽化后1～2周的成蟲,不區分雌雄。

1.2.2 馬鈴薯莖線蟲的培養

馬鈴薯莖線蟲由西北師范大學生命科學學院中藥質量研發與產品開發實驗室提供,經西北師范大學生命科學學院周峰老師鑒定確認。用培養有灰葡萄孢的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)進行馬鈴薯莖線蟲的培養。培養溫度為25 ℃,相對濕度80%～90%。實驗試蟲為培養15 d左右的線蟲。

1.3 提取物制備實驗方法

稱取粉碎后的千里香杜鵑植物樣品枝、葉粗粉各約30 g,用石油醚(沸程：60～90 ℃)、體積分數95%乙醇、甲醇微沸回流提取2次,2次的料液比分別為1∶10和1∶8;提取時間分別為1 h和50 min。合并濾液,減壓抽濾,濾液經旋轉蒸發、濃縮,得到植物提取液浸膏。然后將經石油醚提取后的枝、葉晾干,分別加入甲醇,用同樣的方法,即可得到脫脂枝甲醇提取物和脫脂葉甲醇提取物,再對所得提取物進行稱量,分別計算出膏率。出膏率=m(浸膏)/m(樣品)×100%。最后,將所得提取物浸膏置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.4 活性測試實驗方法

1.4.1 赤擬谷盜和煙草甲觸殺活性測試

采用點滴法[22],從飼養的試蟲中各挑選10頭健全的活性較好且大小一致的成蟲(不分雌雄),將其置于活性測試玻璃瓶(高5.5 cm,直徑2.5 cm)中。用丙酮稀釋待測液,得到5個濃度梯度。首先將試蟲置于培養皿蓋內,用冰袋將試蟲麻痹,用移液器移取0.5 μL待測樣品的丙酮稀釋液,將其滴于試蟲的前胸背板,再將試蟲盡數裝入各自測試玻璃瓶,置于溫度28～30 ℃,相對濕度(75±5)%的培養箱中培養。以除蟲菊脂為陽性對照,丙酮為陰性對照。每個濃度均重復5次,每次均10頭試蟲,24 h后觀察和記錄試蟲死亡/存活情況。利用SPSS V22.0軟件統計分析計算半致死劑量LD50。

1.4.2 馬鈴薯莖線蟲毒殺活性測試

參照文獻[23],將待測樣品用5%吐溫-80和2%DMSO水溶液配制成一定濃度的待測樣品稀釋液。通過預實驗確定合適的測試濃度范圍。將10 μL馬鈴薯莖線蟲懸浮液(約100 條線蟲)和90 μL不同濃度的待測樣品稀釋液置于96孔細胞培養板中,置于溫度25 ℃,相對濕度(85±5)%的培養箱中培養,每組處理重復5次。以克百威為陽性對照,等體積的5%吐溫-80和2%DMSO為陰性對照,24 h后觀察記錄各組線蟲的死亡/存活情況。利用SPSS V22.0軟件統計分析計算半致死濃度LC50。

1.4.3 赤擬谷盜和煙草甲熏蒸活性測試

參照文獻[24],從飼養的試蟲中各挑選10頭健全的活性較好且一致的成蟲(不分雌雄),將其置于活性測試玻璃瓶(高5.5 cm,直徑2.5 cm)中。用丙酮稀釋待測液,得到5個濃度梯度。用移液器移取10 μL待測樣品的丙酮稀釋液,將其滴加到測試玻璃瓶蓋內的約為2 cm2的圓形濾紙片上,待溶劑揮發20 s后迅速蓋緊瓶蓋并封口形成密閉空間,置于溫度28～30 ℃,相對濕度(75±5)%的培養箱中培養。赤擬谷盜和煙草甲分別以甲基溴和磷化氫為陽性對照,丙酮為陰性對照。每個濃度均重復5次,每次均20頭試蟲,24 h后觀察和記錄試蟲死亡/存活情況。利用IBMSPSS V22.0軟件統計分析計算半致死濃度LC50。

1.4.4 赤擬谷盜和煙草甲拒食活性測試

參照文獻[25]的研究方法并進行改進,稱取0.8 g小麥粉,吸取不同體積的待測樣品液加80%乙醇稀釋,最后定容至2 mL,搖勻后加入小麥粉中,攪拌均勻,配制成不同濃度的小麥粉混濁液。對照組用2 mL體積分數80%乙醇與小麥粉混勻。將移液槍的槍頭切去部分,取200 μL小麥粉混濁液于培養皿上形成面餅,置于通風櫥中過夜,再置于溫度29～30 ℃,相對濕度(75±5)%的培養箱中平衡水分后形成拒食測試面餅。挑選20頭試蟲于計數瓶中,將試蟲饑餓24 h。稱量空瓶質量,加入面餅后稱質量,然后加入20頭試蟲再稱質量,最后擰緊瓶蓋,將處理組與對照組的計數瓶置于恒溫培養箱中培養。培養3 d后,先稱總瓶質量,然后將試蟲取出,稱取面餅和瓶的總質量,計算試蟲取食量,處理組每個濃度重復5次。拒食率計算公式：拒食率FDI=(C-T)/C×100%,其中C為對照組面餅消耗量;T為處理組面餅消耗量。將拒食率值轉換為反正弦平方根值,采用SPSS V22.0進行ANOVA單因素方差分析(Tuckey’s HSD test),比較拒食均值之間的差異。當P<0.05 時,認為均值之間存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物得率

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物得率見表1。千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物中出膏率最高的為脫脂葉甲醇提取物,得率為29.09%,其次葉95%乙醇提取物和脫脂枝甲醇提取物,得率分別為27.33%、26.32%。枝、葉甲醇提取物和枝95%乙醇提取物的出膏率均在10%～20%之間。枝、葉石油醚提取物的出膏率最低,均低于10%。

表1 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物質出膏率

2.2 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的觸殺活性

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的觸殺活性實驗結果見表2。千里香杜鵑枝、葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜表現出較強觸殺活性,其LD50分別為19.10、15.32 μg/頭。文獻[26-28]報道柳葉亞菊揮發油、千里香杜鵑揮發油、頭花杜鵑揮發油、毛蓮蒿揮發油、雞骨柴揮發油對赤擬谷盜的觸殺活性LD50分別為64.51、29.82、104.92、30.63、26.64 μg/頭,與這些采用相同測試方法的植物揮發油對赤擬谷盜的觸殺活性相比,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物具有較強的觸殺活性,而且觸殺活性明顯高于其他6種提取物,約為石油醚提取物活性的4倍,但與陽性對照相比具有一定差距。

表2 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的觸殺活性

2.3 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對煙草甲的觸殺活性

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對煙草甲的觸殺活性實驗結果見表3。結果表明,脫脂枝甲醇提取物和枝、葉95%乙醇提取物對煙草甲表現出較好的觸殺活性,其LD50分別為28.81、31.08、16.18 μg/頭。柳葉亞菊揮發油、千里香杜鵑揮發油、頭花杜鵑揮發油對煙草甲的觸殺活性LD50值為25.66、29.15、44.40 μg/頭[26-28],與采用相同測試方法的植物揮發油對煙草甲的觸殺活性相比,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物具有較強的觸殺活性。雖然對比陽性對照活性有一定差距,但觸殺活性約為枝、葉石油醚提取物的5.7、10.3倍,這與本研究中千里香杜鵑葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜的觸殺活性測試結果具有一致性。

表3 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對煙草甲的觸殺活性

2.4 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性實驗結果見表4。枝、葉95%乙醇提取物和枝、葉甲醇提取物對馬鈴薯莖線蟲表現出較好的毒殺活性,LC50分別為0.78、0.83、1.24、1.02 mg/mL,其中葉95%乙醇提取物表現出顯著毒殺活性,文獻[29-30]報道絲裂亞菊揮發油、光苞亞菊揮發油、鋪散亞菊揮發油和銀杏甲醇提取物對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性LC50分別為1.50、1.23、3.83、5.12 mg/mL。與這些采用相同測試方法的植物揮發油和植物提取物對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性相比,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物具有較強的毒殺活性,與陽性對照克百威相比,其活性弱于陽性對照,但相比于其他6種提取物具有一定的優勢。

表4 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對馬鈴薯莖線蟲的毒殺活性

2.5 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜和煙草甲的熏蒸活性

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜和煙草甲的熏蒸活性實驗結果見表5和表6。各提取物均對赤擬谷盜和煙草甲表現出較弱熏蒸活性。推測可能是因為熏蒸是可揮發性化合物在密閉環境中殺死害蟲的一種作用方式,而實驗中的植物不同溶劑的提取物不具有揮發性氣味,因此導致不同提取物對害蟲的熏蒸效果較弱。

表5 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的熏蒸活性

表6 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對煙草甲的熏蒸活性

2.6 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的拒食活性

千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜和煙草甲拒食活性實驗結果見表7和表8。千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜和煙草甲均表現出不同程度的拒食活性,且具有濃度依賴性,即隨著測試濃度升高,拒食活性變高,這與一般農藥的作用特點相符合[32]。其中,95%提取物在各測試質量濃度下均對赤擬谷盜表現出較好的拒食活性,其拒食率在測試質量濃度范圍內為32.54%～78.17%。在質量濃度2.0 mg/mL測試條件下,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜表現出較好拒食活性,拒食率為78.17%,與陽性對照昆蟲拒食劑川楝素相比具有相近的拒食活性。

表7 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對赤擬谷盜的拒食活性

表8 千里香杜鵑枝、葉不同溶劑提取物對煙草甲的拒食活性

千里香杜鵑枝、葉95%乙醇提取物在各測試質量濃度下均對煙草甲表現出較弱的拒食活性,在質量濃度2.0 mg/mL測試條件下的拒食率為 46.12%、48.12%。千里香杜鵑葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜和煙草甲均表現出拒食活性,并且8種提取物在各個測試質量濃度下對赤擬谷盜的拒食活性明顯強于煙草甲,可能是因為2種倉儲害蟲對各提取物的敏感性不同,引起各提取物間的拒食活性存在不同。

因此,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜(LD50=15.32 μg/頭)、煙草甲(LD50=16.18 μg/頭)和馬鈴薯莖線蟲(LC50=0.78 mg/mL)表現出較強觸殺和殺線蟲活性;另外,在質量濃度2.0 mg/mL測試條件下,對赤擬谷盜也表現出較好拒食活性,拒食率為78.17%。說明同一植物的不同部位(千里香杜鵑枝和千里香杜鵑葉)、不同溶劑提取物的抗蟲活性存在差異,其中95%乙醇從千里香杜鵑葉提取到的活性成分中含有較多能抑制赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲活性的有效成分。植物中的殺蟲活性物質主要是植物次生代謝物質,而乙醇是較強的極性溶劑,對植物中的次生代謝物質有較強的溶解性,能夠更有效的提取到植物次生代謝物質。這與張紅建等[13]報道的麻瘋樹、山蒼子和山苦楝的95%乙醇粗提物對赤擬谷盜具有較強的生物活性這一研究結果一致。司愛富等[34]指出乙醇為親水性有機溶劑,大多物質能在乙醇中溶解,親脂性成分在乙醇中的溶解度也較大,乙醇提取物中可能含有鞣質等多羥基的衍生物, 有機酸鹽、生物堿鹽及親水性比較強的苷類物質。植物揮發油的主要成分是一些弱極性的化合物,通常可被乙醇提出,所以在千里香杜鵑葉95%乙醇提取物可能含有一些揮發性成分,而在此前,從千里香杜鵑葉揮發油中鑒定出14種化合物,并用揮發油及其主要成分吉馬酮做了對赤擬谷盜和煙草甲的觸殺活性測試(LD50分別為29.82、0.97、29.15、17.18 μg/頭),發現吉馬酮對赤擬谷盜表現出較好觸殺活性(LD50=0.97 μg/頭),但千里香杜鵑葉揮發油觸殺活性都明顯低于此次千里香杜鵑葉95%乙醇提取物觸殺活性,推測可能是葉95%乙醇提取物中存在的非揮發性成分或者是非揮發性成分與揮發油中的一些弱極性的化合物復配產生了有效抗蟲活性,但究竟是提取物中哪種成分起到有效抗蟲效果,還需要進一步的分離純化及鑒定研究其發揮作用的活性物質,以期得到可對糧油作物種植和儲藏害蟲進行有效且高效防控的活性化合物。另外,本實驗中只測試了對赤擬谷盜和煙草甲成蟲的抗蟲活性,而對其幼蟲和卵的抗蟲活性也還需進一步實驗。

3 結論

分析千里香杜鵑枝、葉經不同溶劑(石油醚、甲醇、95%乙醇)提取得的物質對倉儲害蟲(赤擬谷盜、煙草甲)的觸殺、熏蒸和拒食活性以及其對馬鈴薯莖線蟲的殺線蟲活性。結果表明,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物對赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯莖線蟲具有明顯殺蟲活性;對赤擬谷盜具有明顯拒食活性,與陽性對照拒食活性相近。在本實驗中,盡管與陽性對照相比,千里香杜鵑葉95%乙醇提取物并未表現出更好抗蟲活性,但與其他文獻中報道的運用類似生物測定方法的植物揮發油相比,其對赤擬谷盜、煙草甲和馬鈴薯腐爛莖線蟲表現出更明顯或相近的殺蟲活性,并且植物提取物作為植物源殺蟲劑,具有低毒、易提取、綠色環保等優勢。