美拉德產物-果膠負載CoQ10納米顆粒的制備及研究

黃 欣, 張園園, 顏丹云, 趙祎瑾, 郝建雄, 劉俊果

(河北科技大學食品與生物學院,石家莊 050024)

CoQ10是一種脂溶性物質,不溶于水,具有清除自由基的能力,可以做抗氧化劑[1],能夠有效地預防動脈粥樣硬化的發展,而且能給心臟提供動力,并且CoQ10本身基本沒有毒副作用,對改善身體健康有著著重要的作用。但由于CoQ10見光易分解,而且水溶性差,在食品或者醫藥領域內直接利用具有局限性[2],因此采用納米運載體包埋CoQ10對于提高CoQ10的光、熱穩定性及水溶性有著重要的意義。

大豆分離蛋白來源廣泛,價格低廉,具有較高的營養價值,作為疏水性蛋白是一種優良的生物活性物質載體[3],因其水溶性、乳化性等性質在實際應用中受到限制,直接用作納米載體具有不穩定性[4],因此很多研究者利用改性后的蛋白復合物作為納米運載體,多數研究是關于二元復合物包埋生物活性物質[5,6]。但利用蛋白二元復合物仍可能存在一些問題,為了改善這些問題,添加活性物質制備三元復合物成為一種有效的手段。Guo等[7]在利用豌豆蛋白和果膠的復合物負載白藜蘆醇時,由于親水性果膠不能提供更多的疏水位點,通過添加活性物質增強穩定性。Chang等[8]在包埋姜黃素時,蛋白在等電點處不穩定,使用果膠改善酪蛋白酸鈉/玉米醇溶蛋白復合物的穩定性。本研究前期存在同樣的問題,雖然中性多糖燕麥β-葡聚糖對大豆分離蛋白改性后,使蛋白質的溶解性、乳化性及起泡性得到顯著提升,但蛋白等電點處的應用有一定的局限性,直接用作納米載體不太理想,因此,選用合適的材料改善蛋白在等電點處的穩定性很有必要。

果膠作為一種陰離子多糖,具有無毒易降解等生物特點[9],利用果膠修飾美拉德產物制備出的納米載體不但具有美拉德產物的良好性能,而且果膠的加入可以使蛋白質的等電點酸移,使SPI在pH 4.5處穩定存在,進一步擴大蛋白質的pH利用范圍,這對于在食品或醫藥領域的弱酸性體系中的應用有重要的意義。研究采用美拉德產物-果膠復合物包埋CoQ10制備納米顆粒,并對顆粒的結構表征和功能性質進行探究,旨在制備出一種能有效改善CoQ10穩定性及水溶性差且對人們健康有益的納米顆粒產品,也為制備三元復合物運載體的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

CoQ10標準品、大豆分離蛋白(食品級)、燕麥β-葡聚糖(食品級)、果膠(酯化度55%)、無水乙醇、乙酸乙酯、DPPH標準品、氯化鈉、豬膽鹽、胃蛋白酶(酶活≥250 U/mg)、胰蛋白酶(酶活250 U/mg)、K2HPO4,試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-WS集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,FD-1A-50冷凍干燥機,752型紫外分光光度計,B105高速離心機,NKCP-S10B蠕動泵,RD-201D旋轉蒸發儀,JY92-ⅡN超聲破碎儀,Nicolet6700紅外-拉曼光譜儀,SmartLab8KWX-射線衍射儀,SZ-100-Z納米激光粒度儀,S-4800高分辨率掃描電鏡,DSC-100差示掃描量熱儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 美拉德產物的制備[10]

準確稱取1 g SPI溶于100 mL去離子水中,磁力攪拌30 min,按照SPI與OG 1∶1.2的質量比稱取OG溶于水中,用0.1 mol/L HCl調節pH至7.5,4 ℃冰箱中水合過夜。設置磁力攪拌水浴鍋溫度為35 ℃,先將SPI與OG混合溶液置于水浴鍋中攪拌2.5 h,待溫度調節至85 ℃后繼續反應100 min,然后立即冰浴5 min,樣品可凍干保存。

1.3.2 濁度曲線的繪制

稱取SPI-OG和PEC分別溶于去離子水中,配制質量濃度1 mg/mL的SPI-OG溶液、PEC溶液以及SPI-OG與PEC復合溶液(SPI-OG∶PEC質量比為2∶1、1∶1、1∶2)。用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH將pH從7調至2,在不同pH點取樣并在600 nm下測定OD值。

1.3.3 復凝聚法制備壁材的條件優化[11]

研究SPI-OG與PEC復合體系的不同pH(3.8、4.3、4.8、5.3、5.8)、總質量濃度(1.0、2.5、5.0、7.5、10 mg/mL)、質量比(SPI-OG∶PEC為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對制備壁材的影響。稱取一定質量的SPI-OG及PEC分別溶于去離子水中配制成母液,磁力攪拌2 h,調節母液pH至7,4 ℃冰箱水合過夜,然后將SPI-OG溶液置于磁力攪拌器上,采用蠕動泵將PEC溶液以一定的質量比緩慢滴加到SPI-OG溶液中,調節混合體系的pH使SPI與PEC發生復凝聚反應,繼續攪拌30 min 后將溶液分裝到玻璃試管中,放入80 ℃水浴鍋中反應10 min,待反應結束后立即冰浴5 min。測定樣品的粒徑、Zeta電位及多分散系數(PDI)。

1.3.4 CoQ10納米顆粒的制備

參考Dai等[12]的方法,稍作修改。采用1.3.3中最佳條件制備壁材,CoQ10作為芯材。利用蠕動泵將質量濃度為5 mg/mL的CoQ10無水乙醇溶液滴加到壁材溶液中(其中芯壁比為1∶2.5、1∶5.0、1∶7.5、1∶10.0、1∶12.5),采用乙醇注入-超聲法制備納米顆粒,超聲條件為：功率500 Hz,超聲破碎儀開1 s停1 s,共 4 min。然后將CoQ10納米乳液中的乙醇蒸出,補加去離子水至原體積,測定樣品的粒徑、Zeta電位及PDI。未使用的納米乳液冷凍干燥后保存備用。特別注意CoQ10見光易分解,操作時應避光。

粒徑、電位和PDI的測定：壁材及CoQ10納米乳液的質量濃度為5 mg/mL,濃度大時可進行適當稀釋。使用納米激光粒度儀測定粒徑、Zeta電位及PDI[13]。

1.3.5 包埋率和負載量的測定

參考Lin等[14]的方法,采用有機溶劑萃取法測定納米顆粒中CoQ10的含量。取2 mL納米乳液與5 mL 乙酸乙酯溶液混合,振蕩30 s,6 000 r/min離心20 min,取有機相在275 nm處測定未包埋的CoQ10的含量;同樣取2 mL納米乳液與5 mL乙酸乙酯混合,超聲萃取30 min,6 000 r/min離心20 min,測定納米顆粒體系中CoQ10的總含量。標準曲線方程為Y=0.015 81X-0.005 7(R2=0.999 7)。

式中：m為包埋CoQ10的壁材的質量/g;m0為CoQ10初始總質量/g;m1為未包埋的CoQ10的質量/g。

1.3.6 CoQ10納米顆粒結構表征

1.3.6.1 傅里葉變換紅外光譜

稱取適量CoQ10、壁材以及CoQ10納米顆粒粉末充分研磨,并與溴化鉀混合壓片,然后進行紅外掃描。紅外光譜掃描條件為：波長范圍：400～4 000 cm-1,光譜分辨率4 cm-1。

1.3.6.2 X-射線衍射

將CoQ10、壁材和CoQ10納米顆粒粉末使用研缽充分研磨,填入凹槽中,用玻璃片壓緊,置于儀器上進行測定,檢測條件為：衍射角掃描范圍10°～80°,電壓40 kV,掃描速率5(°)/min。

1.3.6.3 差示掃描量熱法

采用DSC分析CoQ10以及CoQ10納米顆粒的熱性能。稱取適量CoQ10、壁材以及CoQ10納米顆粒粉末,分別放在坩堝內,經壓片機壓片后稱量,然后在儀器上進行測定。檢測條件為：樣品10 mg,升溫范圍：25～100 ℃,升溫速率5(°)/min。

1.3.7 光照和溫度儲存穩定性

將新制備的質量濃度5 mg/mL的CoQ10納米乳液分別置于0、4、25 ℃避光以及25 ℃不避光的條件下來監測納米顆粒中CoQ10的保留率,儲存30 d,每5 d 測1次保留率。

1.3.8 功能性質的測定

1.3.8.1 抗氧化性(DPPH)的測定

DPPH溶液的配制：稱取0.2 mg DPPH溶解于無水乙醇中,用50 mL棕色容量瓶定容。

抗氧化性測定[15]：測定包埋后與包埋前CoQ10的DPPH自由基清除能力,用來研究CoQ10經包埋其抗氧化性是否受到影響。以CoQ10的質量濃度為基準,稱取適量CoQ10納米顆粒分散到乙酸乙酯溶液中超聲破碎,離心后取有機相,使CoQ10的系列質量濃度為20、40、60、80、100 μg/mL。另稱取CoQ10溶解到乙酸乙酯,進行同樣的稀釋。取2 mL樣品溶液與2 mL DPPH醇溶液混合,記作A0,2 mL樣品溶液與2 mL無水乙醇溶液混合,記作A1,2 mLDPPH醇溶液與2 mL無水乙醇混合,記作A,振蕩混勻,避光反應30 min。反應結束后,用2 mL去離子水和2 mL無水乙醇溶液做空白調零,在517 nm處測定紫外吸光度。每個樣品做3組平行。DPPH·清除率的計算公式為：

1.3.8.2 體外溶出度

參考陳程莉[16]的方法。稱取15 mg CoQ10和含有15 mg CoQ10的納米顆粒分散到40 mL模擬胃液(胃蛋白酶3.2 g/L,NaCl 150 mmoL/L,pH 2)中,置于37 ℃、100 r/min的搖床中進行胃液消化反應2 h;2 h 后,將胃消化液pH調至7,再向其中加入40 mL模擬腸液(NaCl 30.72 mmoL/L,CaCl20.3 g/L,豬膽鹽5 g/L,胰蛋白酶8 g/L,pH 7.2)繼續反應2 h。在整個胃腸道消化過程中,每隔15 min進行1次取樣,取出的樣液立即放到-20 ℃下終止反應。將樣液于5 000 r/min下離心15 min,取1 mL上清和3 mL乙酸乙酯混合萃取CoQ10,有機相過0.22 μm濾膜,275 nm下測吸光度。

2 結果和討論

2.1 濁度曲線分析

從圖1中可以看到,在pH 2～7范圍內,PEC的濁度極小,OD值在0.018處上下波動,且基本保持不變,這說明pH的變化對PEC溶液的濁度影響不大;對于SPI-OG來說,pH4.5時濁度值達到最大,這是因為pH 4.5是SPI的等電點。

圖1 PEC、SPI-OG、復合體系的濁度曲線

PEC和SPI-OG形成的復合溶液的濁度曲線均不同于它們各自的曲線,但不同比例下的曲線趨勢大致相同。以質量比1∶1進行分析, pH從7.0至6.2,濁度基本沒有變化,此區域稱為共溶區,這時PEC和SPI-OG還沒有形成復合物;pH 6.2至3.5,濁度緩慢增大,但整體變化不多,此區域稱為可溶性復合物區;pH 3.5至2.0,濁度先快速增大再減小,此時PEC和SPI-OG形成的復合物會聚集沉淀,稱為不可溶性復合物區。在復合物形成變化的過程中,pH 6.2和pH 3.5是2.0個臨界點,因此在后續制備納米顆粒的壁材時,選取pH 3.5～6.2作為pH研究范圍。

2.2 復凝聚法制備壁材的條件優化

2.2.1 不同pH對制備壁材的影響

pH對于使用陰離子多糖和蛋白產制備壁材是非常重要的。由圖2可知,隨著pH值的增大,粒徑和Zeta電位先增大后減小,PDI的值不斷增大,但沒有超過0.3,穩定性較好。pH 4.5以下復合物的粒徑、PDI及Zeta電位均較小,這是由于pH小于4.5時,果膠帶負電,蛋白帶正電,體系內存在靜電引力[17],二者結合的更加緊密,形成的復合物也更加穩定;而當pH大于4.5時,粒徑和電位值不斷減小,PDI值增大,這可能是由于PEC和SPI因斥力的存在,形成的大分子復合物較少,整個體系較為松散。因此,主要依靠PEC和蛋白之間的靜電引力制備復合物,選取pH 3.8作為制備壁材的最佳pH。

圖2 不同pH對壁材粒徑、電位和PDI的影響

2.2.2 不同總質量濃度對制備壁材的影響

從圖3中可以看到,質量濃度1.0、2.5、5.0 mg/mL時的粒徑較小,大于5.0 mg/mL時,體系內由于分子數量變多,更容易聚集形成大尺寸的復合物,導致粒徑劇增。此外,所有質量濃度下復合物的Zeta電位均在-26 mV以下,PDI均小于0.3,這說明在這些質量濃度下的溶液體系都能保持穩定[18];其中復合物總質量濃度為5.0 mg/mL時,PDI和Zeta電位是最小的,因此選擇5.0 mg/mL作為制備壁材的最佳總質量濃度。

圖3 不同總質量濃度對壁材粒徑、電位和PDI的影響

2.2.3 不同質量比對壁材的影響

圖4中質量比為1∶1時,粒徑和PDI最小,PEC或SPI-OG過量時,粒徑以及PDI就會增大,這可能是由于反應物過量,反應不能充分進行,體系的穩定性就會下降;Zeta電位隨著質量比由3∶1至1∶2逐漸降低,質量比1∶3時電位值稍高于1∶2的電位值,這可能是因為PEC是陰離子多糖,PEC濃度越大,體系的電位值就越小[19]。因此,質量比1∶1時粒徑最小、PDI值最小,Zeta電位值在-27 mV左右,雖然不是最小,但比較穩定。因此選取1∶1作為制備壁材的質量比。

圖4 不同質量比對壁材粒徑、電位和PDI的影響

2.3 CoQ10納米顆粒的制備

制備負載生物活性物質的納米顆粒時,壁材和芯材的質量比是非常重要的。圖5是壁材與CoQ10的不同質量比對制備CoQ10納米顆粒的影響。可以看出,按照不同芯壁比制備的CoQ10納米顆粒的粒徑相差不大,1∶7.5和1∶12.5時粒徑較小,芯壁比1∶7.5時,Zeta電位值最小,為-21.4 mV,1∶5.0時PDI最小,為0.19;其中不同芯壁比的PDI值均在0.2左右,說明這幾種溶液體系的狀態都比較穩定。結合粒徑、PDI、Zeta電位指標可知1∶7.5是最佳芯壁比。

圖5 不同質量比對CoQ10納米顆粒粒徑、電位和PDI的影響

2.4 包埋率和負載量分析

從圖6中可以看到,負載量隨著CoQ10的減少而下降,包埋率隨著CoQ10質量濃度的增大先上升后下降,這是因為CoQ10的用量達到一定程度時,會超過壁材的包埋限度,包埋率就會下降,而且會導致整個體系不穩定。壁材與CoQ10的質量比為1∶10.0時,包埋率最高,達到71.71%,略高于1∶7.5時70.58%的包埋率。考慮到實際生產中,盡量減少壁材的用量,提高CoQ10的包埋率進而提高生產效率[20],因此選擇質量比為1∶7.5作為制備CoQ10納米顆粒的最佳比例。

圖6 不同質量比CoQ10納米顆粒的包埋率和負載量

2.5 CoQ10納米顆粒結構表征分析

2.5.1 紅外光譜分析

圖7 CoQ10、壁材、CoQ10納米顆粒的紅外圖譜

2.5.2 X-射線衍射分析

XRD常用來觀察分析晶體的結晶峰[28]。從圖8中可以看到,CoQ10出現明顯的結晶峰,尤其在18°和24°附近存在高強度且尖銳的衍射峰,說明CoQ10具有結晶特性[29];CoQ10納米顆粒和壁材的譜圖極為相似,在15°～35°范圍內出現一個很小鼓包,未出現衍射峰,可能是CoQ10被裝載到壁材中,結晶水平降低[30],由晶體結構轉化為無定形形式存在,這與謝灝婷等[31]研究蝦青素經包埋后尖銳的衍射峰消失的現象較為相似,進而表明CoQ10納米顆粒的形成。

圖8 CoQ10、壁材、CoQ10納米顆粒的X-衍射圖譜

圖9 CoQ10、壁材、CoQ10納米顆粒的差示掃描量熱圖

2.5.3 差示掃描量熱分析

CoQ10由于具有晶體結構,在熔化的過程中表現出明顯的吸熱峰,圖8中可看到其熔點為60.2 ℃;壁材的吸熱曲線趨于直線,這是因為壁材屬于無晶型物質,所以沒有吸收峰;從CoQ10納米顆粒的吸熱曲線中可以觀察到,熔點52.3 ℃處出現了小峰,沒有出現晶體物質明顯的特征峰,而且與CoQ10相比,熔點下降了7.8 ℃,這是因為穩定的晶體熔點高,不規則結晶熔點低,說明CoQ10以無定形形式存在于壁材中導致納米顆粒熔點變低[32,33]。此外CoQ10納米顆粒的曲線與壁材相似,同樣可以證實CoQ10被包埋在壁材中。結合分析可知,SPI-OG-PEC這種壁材可以較好的包埋CoQ10制成納米顆粒,是一種良好的遞送載體,同時可以考慮傳遞其他藥物的研究[34]。

2.6 光照和溫度儲存穩定性分析

圖10中是不同溫度及光照條件對納米顆粒中CoQ10保留率的影響。溫度方面,在0、4、25 ℃避光條件下,0 ℃的保留率最高,25 ℃的相對較低,說明低溫更有利于納米乳液的儲存[35]。光照方面,從25 ℃避光與不避光的曲線來看,避光條件下的保留率在5 d后緩慢下降,30 d后保留率為76.0%;不避光條件下的保留率在0～25 d內持續下降,之后趨于平緩,30 d后僅剩57.8%,這可能是由于光照對CoQ10的影響大,使其發生了降解導致保留率迅速下降。因此,對于CoQ10納米顆粒的儲存應選擇低溫避光的條件。

圖10 CoQ10納米顆粒在不同條件下儲存時CoQ10的保留率

2.7 功能性質分析

2.7.1 抗氧化性(DPPH)分析

CoQ10具有抗氧化性,如果被包埋的CoQ10活性下降,就會降低CoQ10的可利用度。圖11中可以看到,經包埋后,納米顆粒中CoQ10的清除率與原CoQ10相差不大,其中在20～60 μg/mL范圍內,納米顆粒中CoQ10的清除率略低于CoQ10的清除率,這可能是由于在操作過程中物理或者化學反應等帶來了一些影響,導致納米顆粒中CoQ10的活性產生了小幅度的下降。總體來看,納米顆粒中CoQ10的抗氧化活性與CoQ10基本接近,因此,包埋過程對CoQ10的抗氧化性影響極小。

圖11 不同質量濃度的CoQ10DPPH·清除率

2.7.2 體外溶出度分析

CoQ10由于存在光照、加熱條件下易分解,水溶性差等問題,很難直接使用,因此提高CoQ10的生物利用度是至關重要的。從圖12胃腸道模擬的溶出曲線可以看到,在胃液中釋放的120 min內,CoQ10的溶出量沒有太大變化,基本接近于0,加入腸液后,溶出量稍稍提高,在150 min后基本不在變化;CoQ10納米顆粒的累計溶出量遠大于CoQ10的溶出量,在0～60 min內,CoQ10納米顆粒在胃液中的累計溶出量快速增加,60～120 min內,累計溶出量增加幅度變小,在120 min加入腸液后,稍稍增大然后趨平。因此,單獨的CoQ10溶出量較低,很難被利用,而制備成納米顆粒后,整體的累計溶出量明顯增大,與文獻中提高溶出量結果一致[36],這是因為CoQ10被包埋后提高了其水分散性,所以將CoQ10制成納米顆粒可以提高生物利用度。對于其他不溶于水的生物活性物質,同樣可以將其制成納米顆粒或者微膠囊,提高水分散性以及光或者熱穩定性等,進而增大利用度[37]。

圖12 CoQ10和CoQ10納米顆粒的體外溶出度曲線

3 結論

這項研究通過復凝聚法制備壁材,利用乙醇注入-超聲法制備了CoQ10納米顆粒。結果表明,pH3.8、復合物總質量濃度5 mg/mL、質量比1∶1時制備的壁材是最穩定的;芯壁比1∶7.5是制備納米顆粒的最佳比例。結構表征方面,紅外光譜、X-射線衍射、差示掃描量熱的譜圖經分析均表明CoQ10被包埋在壁材中,證實了CoQ10納米顆粒的形成。溫度和光照穩定性的研究可知低溫以及避光可以較好地儲存CoQ10納米顆粒。功能性質方面,CoQ10包埋后其DPPH清除自由基的能力沒有太大變化,胃腸道模擬發現CoQ10納米顆粒的溶出度明顯高于CoQ10的溶出度,說明CoQ10納米顆粒的制備基本上沒有破壞CoQ10的活性,而且在一定程度上提高了CoQ10的水分散性和生物利用度。這為以后研究CoQ10的生物可利用度以及采用納米顆粒包埋穩定性差、水溶性差的生物活性物質提供了參考。