改性綠豆蛋白與小麥蛋白相互作用對其凝膠特性的影響

陶 陽, 陳洪生, 王長遠, 刁靜靜

(黑龍江八一農墾大學食品學院1,大慶 163319)

(黑龍江八一農墾大學國家雜糧工程技術研究中心2,大慶 163319)

綠豆蛋白質是一種高品質的天然植物蛋白,且具有優質的氨基酸組成,其必需氨基酸占總氨基酸的43.5%,營養評分超過世界糧農組織和衛生組織的推薦值[1],可彌補一般糧食作物蛋白質不足的營養缺陷。另外,綠豆蛋白還具有多種有益的生物活性,如改善葡萄糖代謝、脂質代謝、預防和控制非酒精性脂肪肝等[2]。然而,綠豆蛋白在實際工業化生產中,常作為淀粉加工副產物被廉價出售,造成了優質蛋白資源的浪費,這是由于綠豆蛋白的溶解性、凝膠能力、乳化能力等工特性都較差,限制了其在食品工業中的應用[3]。面條是我國傳統的主食食品,深受消費者的喜愛,多年來由于豆類缺少面筋蛋白而無法在面條中得到良好的應用,因此面條多以小麥等谷物為原料。谷類蛋白質與豆類蛋白質單獨食用不能完全滿足人體對必需氨基酸的需求[2],Tazrart等[4]研究發現豆類與谷類蛋白質的氨基酸可以實現蛋白質間氨基酸的互補,因此在面制品加工過程中,可以通過向面制品中添加豆類蛋白來達到蛋白互補的作用,改善面制品的口感和品質。

凝膠特性是影響面條品質的主要因素,綠豆蛋白中含硫氨基酸較少,影響了綠豆蛋白凝膠性,因而限制了且在面條中的應用。研究表明蛋白與蛋白間能夠通過相互作用發生交聯,從而增加復合體系的凝膠特性[5]。劉鑫碩等[6]發現馬鈴薯蛋白與蛋清蛋白混合能夠顯著提升混合凝膠的硬度和保水性。杜洪振等[7]發現大豆蛋白與鯉魚肌原纖維蛋白相互作用能夠改善復合凝膠的凝膠強度和流變特性,且預熱后的大豆蛋白對凝膠特性的改善效果更顯著。Tang等[5]通過對比綠豆蛋白、蕓豆蛋白和紅豆蛋白的凝膠特性的發現綠豆蛋白的凝膠特性最差,其凝膠強度與其他蛋白相比低了53%,無法制成成品,需要通過改變加工方式或增強與其他蛋白的相互作用改善其凝膠性。在前期研究得到的凝膠化綠豆改性蛋白(MMBP)的基礎上,將其應用在面條中,分析MMBP對面條食用品質的影響,并進一步探討MMBP在面條中與小麥蛋白相互作用對凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆蛋白(純度94%),小麥蛋白(純度97%),小麥粉均為食品級,蛋白Marker(SM0431);考馬斯亮藍G250,β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol, β-ME),氯化鈉、磷酸鹽、三氯乙酸、氯化鎂、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯仿、甲醇等均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9245A鼓風干燥箱,TA.new plus質構儀,TG16-WS離心機,SM-YMZD500壓面機,NMI20-015V-I低場核磁共振儀,Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機,MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜儀,DYY-8C型垂直電泳儀,SU3400掃描電子顯微鏡,NMI20-015V-I低場核磁共振儀,AR2000ex動態流變儀,RF6000原子熒光光譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 改性綠豆蛋白面條的制備

濕熱改性條件按喬昂等[8]方法制備,稱取適量綠豆蛋白粉放入托盤中,鋪平,用噴壺均勻噴灑控制含水量,用保鮮膜密封后放入鼓風干燥箱中。根據前期改性條件優化得出綠豆蛋白改性條件為：溫度85 ℃、時間60 min、含水量25%,并將此條件處理后的MMBP(蛋白質質量分數94%、含水量4.7%)分別將0.0%、3.0%、4.5%、6.0%、7.5%、9.0%的MMBP(該比例是根據人體每日65 g蛋白攝入量在一日三餐中所占比例確定)加入小麥粉中制成不同比例的混合粉。

參考LS/T 3202—1993《面條專用粉》附錄的方法,并做一定改進。具體操作為：準確稱取100 g混合粉于不銹鋼盆中,加入44%的水(水溫為25 ℃左右),中速攪拌和面10 min,使料坯手握成團,成為顆粒大小分布均勻的面絮絮,然后蓋上4層濕紗布保濕,放置于溫度為25 ℃的生化培養箱中醒發25 min。調整面條機壓輯間距為2.0 mm,壓片、合片成型后,從壓棍間距1.0 mm壓片,最后切成2.0 mm寬面條備用。

1.3.2 改性綠豆蛋白面條品質測定

1.3.2.1 蒸煮損失測定

取20 g面條放入500 mL沸水中,煮制9 min后撈出,把煮后的面湯倒入不銹鋼盆(m1,g)中,放入烘箱,在105 ℃溫度下烘干至恒重(m2,g),計算損失率。

(1)

1.3.2.2 面條斷條率

取30根相同長度的面條,放入500 mL沸水中煮4 min,用筷子輕輕取出面條,統計未斷條的面條數量,計算斷條率。進行3次平行實驗求平均值。

(2)

1.3.2.3 面條干物質吸水率

取30根面條稱質量,記為m1,置于1 000 mL沸水中烹煮至白芯消失,挑出所有面條后放入500 mL冷水中浸泡2 min,將面條撈出置于雙層紗布上靜置2 min,稱質量,記為m2。

(3)

1.3.2.4 面條最佳蒸煮時間

取30根面條,置于1 000 mL沸水中并立即開始計時。從第3 min起,每隔10 s取出3根面條用2塊透明玻璃壓開,觀察面條中間的白芯變化。白芯剛剛消失的時間即為面條的最佳蒸煮時間。

1.3.2.5 面條質構特性

按照面條最佳煮制時間煮熟,撈出用自來水沖淋30 s并瀝干水分后,進行質構分析。實驗采用的質構儀探頭型號為：P50,設置壓縮模式,測前速度2.0 mm/s,測后速度1.0 mm/s,應變70%,接觸力5 g,間隔時間1 s。

1.3.3 MMBP-WP復合物凝膠的制備

將MMBP按質量分數0%、3%、6%、9%分別與小麥蛋白粉混合制成MMBP-WP復合物,然后取一定比例復合物制成質量分數為20%溶液,90 ℃下保溫30 min,室溫下靜置,冷卻后在4 ℃下過夜保存備用。

1.3.4 MMBP-WP復合物理化特性測定

1.3.4.1 吸水性

稱取1 g蛋白復合物與20 g去離子水混合,渦旋2 min,在室溫下靜置80 min 后離心,將上清液小心倒出并稱質量。蛋白質吸水性計算見式(4)。

(4)

式中：m1為去離子水的質量/g;m2為上清液的質量/g;w為分離蛋白的質量/g。

1.3.4.2 吸油性

稱取1 g蛋白復合物與10 g大豆油混合,渦旋2 min,在室溫下靜置30 min 后離心,期間每5 min 渦旋30 s,將上部油小心倒出并稱質量。蛋白質的吸油性計算見式(5)。

(5)

式中：m1為大豆油的質量/g;m2為上部油的質量/g;m為分離蛋白的質量/g。

1.3.4.3 凝膠強度

采用TA.newplu物性分析儀進行穿刺實驗法。測定條件為：選用P/0.5探頭,探頭運行速度1.0 mm/s,穿刺過程中的運行速度0.5 mm/s,返回速度10 mm/s,穿刺距離5 mm,觸發應力1 g。所得質構曲線中,x軸上方曲線的第1個峰所對應的力代表凝膠強度。

1.3.5 MMBP-WP復合物結構特性測定

1.3.5.1 紅外光譜的測定

稱取0.002 g干樣品與0.2 g溴化鉀,將二者混合研磨均勻后壓片測定FTIR。在4 000～400 cm-1處測定吸收光譜,分辨率4 cm-1,波數精度0.01 cm-1,掃描次數64次,環境溫度25 ℃。

1.3.5.2 二硫鍵含量測定

參照Ellman等[9]的方法進行測定。取75 mg樣品充分溶解于10 mL 8 mol/L尿素Tris-Gly緩沖液中。測定游離巰基的方法：1 mL蛋白溶液中加入4 mL Tris-Gly緩沖液、0.05 mL Ellman試劑(DTNB),反應5 min后于412 nm波長下測定吸光度。測定總巰基的方法：1 mL蛋白溶液中加入0.05 mLβ-巰基乙醇、4 mL Tris-Gly緩沖液,室溫反應1 h,加入10 mL質量分數為12%的三氯乙酸,繼續反應1 h,4 000 r/min離心10 min,沉淀中加入5 mL質量分數12%三氯乙酸并再次以相同條件離心。收集沉淀,將其溶于10 mL Tris-Gly緩沖液,移取4 mL,加入0.04 mL Ellman試劑,反應5 min后于412 nm波長下測定吸光度值。利用式(6)、式(7)計算二硫鍵含量。

(6)

(7)

式中：C為樣品質量濃度/mg/mL;D為稀釋常數;73.53為13 600 L/(mol·cm)的摩爾吸光系數。

1.3.5.3 SDS-PAGE 測定

取0.5 mg/mL的樣品溶液1 mL,加入1 mL樣品緩沖液(0.25 mol/LTris-HCl,質量分數0.5%溴酚藍,質量分數10%SDS,質量分數50%甘油,質量分數5% β-疏基乙醇)混勻,-20 ℃儲存,沸水煮制3～5 min使蛋白充分變性。上層濃縮膠的質量分數和下層分離膠的質量分數分別為5%、12%,上樣體積為10 μL。起初電壓80 V恒壓,到分離膠電壓改為120 V,當條帶接近膠板下邊緣時停止電泳。并用考馬斯亮藍G250染色后進行洗脫。

1.3.5.4 水分分布測定

將制備好的復合物凝膠樣品用保鮮膜密封,4 ℃冷藏12 h,取出后室溫放置30 min,取制備好的復合物凝膠切成高為3 cm的圓柱體,用核磁專用的白色薄膜將其完全包裹,放入專用試管的底部,置于磁場的中心位置,用脈沖序列進行掃描,測定樣品的弛豫時間。每個樣品重復測定3次。參數設置：TD=140 000;SW=300 kHz;TW=2 000 ms;NS=5;TE=0.200 ms;NECH=3 000。

1.3.5.5 流變特性分析

將樣品膠體放置在流變儀的平板上,平板間距設置為2.0 mm。并使樣品在測試前平衡5 min并保持恒溫。采用溫度掃描實驗,設置參數：應變3%,頻率2 Hz,溫度以4 ℃/min的升溫速率從25 ℃升高到100 ℃。

1.3.5.6 熒光光譜分析

將MMBP-WP復合物配制成質量分數0%、3%、6%、9%MMBP的溶液,設置熒光光譜的測定條件為激發波長290 nm,掃描波長300～500 nm,激發狹縫與發射狹縫寬均為5 nm。

1.3.5.7 掃描電鏡分析

分別取2.0 g MMBP-WP復合物樣品(質量分數0%、3%、6%、9%)進行真空冷凍干燥,其中0%MMBP質量分數組(即小麥蛋白)為對照組,然后選取凍干樣品部分中心處切片,將其固定在粘貼有導電雙面膠的樣品臺上,噴灑鉑,通過掃描電鏡在放大倍數200×下觀察。

1.4 數據處理

實驗均進行3次平行,數據處理采用Excel 2010、Origin 2018、Sigma Plot13.0軟件進行分析和作圖,采用SPSS Statistics 24.0軟件中的Duncan法進行數據顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 MMBP對MMBP-WP復合物理化特性的影響

2.1.1 MMBP添加對面條蒸煮特性的影響

蒸煮特性面條最基本的品質特性。圖1a為MMBP添加量對面條蒸煮損失和斷條率的影響,與未添加MMBP相比,當質量分數≤6.0%時,面條蒸煮損失率和斷條率均呈現逐步降低的趨勢。王凱強[10]發現面筋網絡的形成是小麥蛋白通過水合作用形成的凝膠結構,影響著面條的蒸煮品質。在面條熟制過程中,MMBP與小麥蛋白在水分子的作用下,發生交聯形成了較為規則的凝膠結構,對面筋結構起到支撐作用,從而減少了斷條率和蒸煮損失。當MMBP質量分數大于6.0%時,面條的蒸煮損失率和斷條率增加了2倍以上,差異顯著(P<0.05)。這是由于過量的MMBP會與小麥蛋白競爭吸水并與水發生結合,從而影響了蛋白間的交聯使凝膠結構斷裂,導致煮制時面條蒸煮損失和斷條率增加。

圖1 MMBP添加量對面條蒸煮特性的影響

圖1b為MMBP添加量對面條干物質吸水率的影響,與未添加MMBP相比,添加MMBP的面條吸水率均高于對照組,當質量分數為6.0%時,吸水率增加了46.6%;當質量分數高于6.0%,吸水率開始下降。這是由于MMBP在面條蒸煮過程中會與小麥蛋白形成交聯結構,增加與水結合的能力,使整體的吸水率升高。過量的MMBP會與小麥蛋白競爭吸收水分破壞了蛋白間的交聯,使交聯結構與水分子的相互作用減少,水合能力降低,導致面筋網絡的吸水能力和持水能力下降,這與尹顯婷等[11]研究大豆蛋白對面條蒸煮特性的影響結果相似。研究結果還表明各個處理組對蒸煮時間沒有顯著影響(P>0.05)。面條的蒸煮時間主要受到品種影響,說明添加MMBP不會影響面條的蒸煮時間。

2.1.2 MMBP添加對面條質構特性的影響

MMBP對面條質構特性的影響如表1所示,與未添加MMBP的面條相比,添加MMBP對面條的彈性、硬度和咀嚼性呈現先增加后降低的趨勢(P<0.05)。咀嚼性、彈性的變化趨勢與硬度的變化一致,主要是因為咀嚼性與硬度呈正相關。面條的硬度取決于面筋的形成程度[11]。在質量分數為7.5%時,面條的硬度相較于未添加MMBP組增加了55.4%,此時咀嚼度較低,這說明硬度過大會不利于面條的口感。在MMBP質量分數為6.0%時彈性最高,較未添加MMBP組增加了20.3%,此時硬度適中,咀嚼性與未添加MMBP組差異不顯著(P>0.05),這可能與質量分數6.0% MMBP和小麥蛋白能形成穩定的凝膠結構,具有較高的持水力有關。在面條蒸煮過程中,MMBP與小麥蛋白發生相互作用形成致密的凝膠結構,從而促進面筋網絡的形成,并對已經形成的面筋結構起到支撐作用,使面條的彈性逐漸增加[12];但是過量的MMBP加入到面條中使吸水率降低(圖1b),增加了面條的硬度,使彈性降低、營養物質流失、斷條率增加,這與蒸煮損失的結果相一致。

表1 MMBP添加對面條質構特性的影響

2.2 MMBP與小麥蛋白相互作用研究

2.2.1 MMBP添加量對MMBP-WP復合物吸水性及吸油性的影響

蛋白質持水力與其形成的凝膠網絡結構有關。由圖2可知,隨著MMBP添加量的增加,MMBP-WP復合物的吸水性呈現上升的趨勢,在質量分數為6.0%時相較于未添加MMBP組提高了18.9%,達到最高。這可能是因為MMBP與小麥蛋白發生了相互作用,形成了分子間的交聯,從而增加了與水的作用力,同時MMBP與小麥蛋白共同吸收水分,從而使MMBP-WP的吸水性增加[13]。當質量分數大于6.0%時,過量的MMBP與小麥蛋白發生競爭吸水,使凝膠結構與水分子的作用力降低,導致復合物的吸水性降低。MMBP-WP的吸水性與面條吸水率的結果相一致,由此推測面條的品質可能與MMBP-WP復合物的凝膠品質有關。

圖2 MMBP添加量對MMBP-WP復合物吸水性及吸油性影響

吸油性是植物蛋白乳化性和凝膠性能的綜合效應,是決定面制品品質的重要因素之一。隨著MMBP的添加,吸油性整體呈現上升趨勢,在質量分數大于6.0%時吸油性顯著下降(P<0.05)。尹顯婷等[11]發現蛋白的吸油性與蛋白表面疏水基團的暴露程度有關。由此可以推測,隨著MMBP的添加,MMBP與小麥蛋白相互作用生成了MMBP-WP導致小麥蛋白的構象發生了改變,使表面疏水基團的暴露程度升高,從而使吸油性上升;但是過量的MMBP會破壞復合物的結構,使交聯結構發生改變導致對油的截留能力降低,所以在MMBP質量分數大于6.0%時吸油性降低。因此,適量添加MMBP會對面條在加工與蒸煮過程中的品質有一定的促進作用。

2.2.2 MMBP對MMBP-WP復合物二級結構的影響

為了考察MMBP添加量對MMBP-WP復合物結構的變化,利用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)分析凝膠中蛋白質分子的二級結構,如圖3所示。與空白組相比,MMBP處理組在3 500～31 000 cm-1(締合N—H)附近的吸收峰均變窄,在質量分數小于6.0%時變化不顯著,大于6.0%的MMBP處理組在3 450～3 200 cm-1(締合O—H)處均出現較強的尖銳峰,且1 600～1 700 cm-1(酰胺Ⅰ帶)的峰值發生了紅移。這說明添加MMBP會使小麥蛋白的二級結構改變,使小麥蛋白分子內化學鍵斷裂,N—H鍵發生締合反應,增加了蛋白分子間的作用,使MMBP與小麥蛋白能夠發生交聯形成凝膠結構[13]。但是過量的MMBP會增加復合物凝膠與水結合的能力,使締合O—H增加,從而破壞了MMBP與小麥蛋白的交聯結構,從而證實了研究中過量的MMBP會影響凝膠的水合能力的推測,這與唐婷婷等[14]研究卵蛋白與大豆分離蛋白的凝膠結構的結果相一致。

圖3 MMBP添加量對MMBP-WP復合物的FTIR圖譜的影響

通過對酰胺Ⅰ帶進行傅里葉去卷積光譜擬合分析得到表2,隨著MMBP添加量的增加,復合體系蛋白質二級結構中β-折疊含量和α-螺旋含量呈現先增加后減少的趨勢,說明MMBP的添加會對小麥蛋白的二級結構造成影響。有研究表明凝膠強度與α-螺旋/β-折疊結構的比值有關,二者比值越低,凝膠強度和保水性更理想[15]。由表3可知,當MMBP質量分數小于6.0%時,α-螺旋/β-折疊的值由0.67降低到了0.52,這說明MMBP能夠促進MMBP與小麥蛋白分子間發生聚集,從而使β-折疊含量升高,并且β-折疊含量增加代表分子間有更多的空隙,能夠容納更多的水分,使凝膠的保水性增強。此外β-折疊是分子間氫鍵維持的有序結構,β-折疊含量增加也說明分子間的作用力增加,這與前文締合N-H發生偏移的結果相一致。張艷杰等[16]研究發現在小麥面筋蛋白中加入燕麥抗凍蛋白會出現新的分子交聯,從而改變小麥蛋白的二級結構。因此,添加小于6.0%的MMBP能夠與小麥蛋白發生交聯形成凝膠結構,并通過改變其二級結構來改善凝膠的性質。

表2 MMBP-WP復合物的二級結構組成

2.2.3 MMBP對MMBP-WP復合物二硫鍵的影響

二硫鍵是促進蛋白間的交聯,維持蛋白凝膠結構的共價鍵。由圖4可見,隨著MMBP添加量的增加,二硫鍵含量呈現先上升后下降的趨勢,且在添加6.0%MMBP時二硫鍵質量分數增加了54.9%,達到最高,此趨勢與前文β-折疊含量的變化一致。這是由于β-折疊能夠增加蛋白之間的聚集程度,從而使鏈接交聯結構的二硫鍵含量增加,且有研究表明,二硫鍵含量與β-折疊含量呈正相關,共同影響物質的凝膠性。大多研究表明,二硫鍵中的扭式-扭式-反式構象的存在與凝膠的形成密不可分,2種蛋白在凝膠的形成過程中,會發生巰基向二硫鍵的轉化,并通過疏水作用使蛋白通過二硫鍵形成聚集體,逐漸形成凝膠結構[17]。因此,在MMBP質量分數小于6.0%時,MMBP與小麥蛋白通過二硫鍵發生交聯形成凝膠結構,使二硫鍵含量增加;結合二級結構結果可知,過量的MMBP會使復合物凝膠與水分子的結合力增加,從而破壞MMBP與小麥蛋白的交聯結構,降低二硫鍵含量。在MMBP的質量分數為6.0%時,二硫鍵含量最高,此時生成了結構致密的MMBP-WP凝膠結構,水合作用最強,與在質量分數為6.0%時凝膠吸水性最高的結果相一致。

圖4 MMBP添加量對MMBP-WP復合物二硫鍵含量的影響

2.2.4 MMBP添加量對MMBP-WP復合物SDS-PAGE的影響

蛋白質凝膠性能主要取決于其蛋白質組分,對復合凝膠的蛋白質組成進行分析是研究其凝膠性能的前提和基礎。如圖5所示,與未添加MMBP組相比,45.0～66.2 ku附近出現新的亞基條帶,且隨著MMBP的加入,條帶逐漸清晰顏色逐漸變深,這說明MMBP能夠與小麥蛋白發生交聯作用形成分子質量更大的聚集體,這可能是因為MMBP與小麥蛋白的變性溫度(85～90 ℃)和凝膠原理相似的原因[5]。在MMBP質量分數為6.0%時,混合蛋白圖譜的分離膠上方形成的大分子蛋白譜帶比其他添加量的條帶顏色更深且更加厚實,這說明此時MMBP與小麥蛋白的交聯程度最大,大分子聚合物生成量最多,有利于形成穩定的凝膠結構。王卉楠等[18]在研究植物分離蛋白與帶魚肌球蛋白相互作用的電泳結果中發現了這種復合凝膠是蛋白間通過二硫鍵發生交聯形成的,因此在MMBP質量分數大于6.0%時大分子蛋白條帶均變淺是因為亞基都參與了MMBP與小麥蛋白的共價交聯,而過量的MMBP會破壞交聯結構使二硫鍵含量降低,導致MMBP與小麥蛋白的交聯發生解聚,大分子聚合物發生不同程度的降解。MMBP質量分數為6.0%時二硫鍵含量最多且電泳條帶最深,驗證了MMBP與小麥蛋白間通過二硫鍵生成大分子量聚合物的猜想。

圖5 不同MMBP添加量下MMBP-WP復合物的SDS-PAGE

2.2.5 MMBP對MMBP-WP復合物凝膠強度的影響

凝膠強度是蛋白凝膠特性重要評價指標,能夠直觀有效的反映蛋白的凝膠特性。由圖6可以看出,隨著MMBP的添加,凝膠強度的變化趨勢總體呈現上升趨勢,質量分數為6.0%時相較于未添加MMBP組增加了29.1%,達到最高。當質量分數>6%時,凝膠強度略有下降,與6.0%相比,差異不顯著。這與二硫鍵的變化趨勢相似,這說明MMBP與小麥蛋白分子間通過二硫鍵發生了相互作用。小麥蛋白含有較多巰基,加熱會使巰基與二硫鍵相互轉化,從而使二硫鍵含量增加作用增強,形成凝膠結構并提高MMBP-WP復合物的凝膠強度。但是MMBP添加量過高會降低復合凝膠與水的相互作用從而破壞交聯結構,阻礙MMBP與小麥蛋白分子間凝膠繼續形成,并破壞MMBP-WP的凝膠結構,使二硫鍵含量降低,凝膠強度略有下降。

圖6 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠強度的影響

2.3 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠特性的影響

2.3.1 MMBP添加量對MMBP-WP復合物流變特性的影響

為進一步分析MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠特性的影響,分別對0.0%、3.0%、6.0%、9.0%MMBP質量分數的MMBP-WP復合物進行分析。圖7是MMBP添加量對MMBP-WP流變特性的影響,隨著溫度的升高,MMBP-WP復合物凝膠的G′和G″均表現出下降的趨勢,且G′一直大于G″。這說明不同比例MMBP-WP復合物隨著溫度升高直接影響著蛋白分子間的相互作用,破壞凝膠的網絡結構,使凝膠的黏彈性發生不同程度的降低。隨著MMBP添加量的增加G′和G″呈現先升高后下降的趨勢,6.0%MMBP組的G′和G″均高于其他處理組,且兩者相較于未添加MMBP組分別增加了15倍和6倍,這說明MMBP的添加能夠顯著提高蛋白凝膠的黏

圖7 MMBP添加量對MMBP-WP復合物流變特性的影響

彈性。蛋白質凝膠的強度與摻入凝膠網絡中的顆粒(聚集體)的量以及這些顆粒之間相互作用的強度顯著相關[19],因此MMBP與小麥蛋白間的相互作用大于小麥蛋白分子間的相互作用,故而添加MMBP能夠顯著增加MMBP-WP的凝膠強度。但當MMBP質量分數>6.0%時,MMBP-WP的G′和G″均顯著降低,這是因為過量的MMBP會使凝膠與水發生過度結合,使MMBP與小麥蛋白的交聯發生斷裂,造成復合凝膠的黏彈性降低,從而影響面條的彈性,這與面條質構中彈性的結果相一致。

2.3.2 MMBP對MMBP-WP復合物水分分布的影響

低場NMR技術可以用來檢測樣品中水的移動性和分布狀態。由圖8可知,WP凝膠樣品中水分分布主要呈現為4個狀態：T21(0.42～3.05 ms)、T22(3.51～30.54 ms)、T23(40.77～331.01 ms)、T24(365.61～805.48 ms)[20]。其中,對凝膠保水性大小在量上有重要貢獻的主要是T23和T24對應分布狀態的水分子。與未添加MMBP組相比,復合物凝膠的弛豫時間T23均向左偏移,在質量分數為9.0%時T24向右偏移。橫向弛豫時間越短,說明水與非水組分的結合更為緊密;橫向弛豫時間越長,表明水分越自由。因此MMBP的添加會增加凝膠與水分子的相互作用,使凝膠與水分子結合更加緊密,但過量的MMBP會使結合水過多從而破壞MMBP與小麥蛋白的凝膠結構,使在凝膠內部的不宜流動水轉化為自由水,這驗證了質量分數超過6.0%時凝膠吸水性降低的結果。

圖8 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠水分分布的影響

2.3.3 MMBP添加量對MMBP-WP復合物熒光特性的影響

蛋白質的內源熒光性主要來源于酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Hpe)和色氨酸(Trp)3種芳香族氨基酸,其中苯丙氨酸殘基多數情況下不能被激發產生熒光,色氨酸殘基作為最主要的發色基團,其色氨酸殘基所處的微環境極性發生的變化時,蛋白質的熒光強度和最大吸收波長也會發生改變[21]。圖9是MMBP不同添加量對復合物熒光特性的影響,與未添加MMBP組相比,MMBP-WP處理組的熒光強度均有增加,這是由于MMBP色氨酸能夠激發熒光,當MMBP與小麥蛋白發生了結合反應,復合物分子得到舒展,使色氨酸得以暴露,增強了復合物的熒光強度;質量分數6.0%時熒光強度強于其他處理組,且波長發生了1nm的藍移,該結果與黎紅梅研究結果一致。當蛋白質分子結構部分展開能夠減少自猝滅,使熒光強度顯著增加[21]。MMBP質量分數>6.0%熒光強度顯著降低。由于過量的MMBP使凝膠與水分子過度結合破壞MMBP與小麥蛋白的相互作用,使復合凝膠結構破壞,蛋白分子間發生重新包埋,從而使MMBP-WP的熒光強度顯著降低,影響了MMBP與小麥蛋白的結合反應,這與Ghobadi等[22]結果一致。

圖9 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠熒光特性的影響

2.3.4 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠微觀結構

MMBP添加量對MMBP-WP凝膠微觀結構的影響如圖10所示。由圖10a可知,未添加MMBP的小麥蛋白凝膠孔洞較大,凝膠網絡比較粗糙;添加3.0%MMBP時(圖10b),凝膠孔隙變小分布均勻,有交聯結構出現;MMBP質量分數為6.0%時,凝膠結構較為致密,但仍有較為有序的空洞和絲狀的交聯結構出現(圖10c)。金郁蔥[23]認為適當的孔洞數目與孔隙大小會增加凝膠的硬度、咀嚼性和內聚性,并且持水性及硬度高的凝膠具有更致密的網絡結構。隨著MMBP添加量的增加,凝膠孔洞縮小且分布均勻,表面光滑但絲狀結構斷裂,有圓形凹陷出現(圖10 d)。因此,在質量分數小于6.0%時,MMBP與小麥蛋白通過絲狀結構發生交聯反應形成凝膠結構,使凝膠呈現規則疏松的網絡結構,增強凝膠的黏彈性、凝膠硬度和保水性,這一結果證實了MMBP能夠與小麥蛋白通過二硫鍵發生交聯形成致密的凝膠網絡結構,從而改善面條品質。但過量的MMBP會破壞MMBP-WP的凝膠和面筋結構,使面條黏彈性降低,硬度增大,表面出現斷裂從而使凝膠品質下降,這與面條質構的結果相一致。MMBP-WP凝膠結構的變化證實了適量的MMBP能與小麥蛋白結合,形成更緊密的蛋白凝膠網絡結構;但是過量的MMBP會使凝膠與水過度結合,從而破壞了凝膠的網絡結構并出現凹陷,使結合水轉變為自由水從凹陷結構中大量流失,凝膠的保水性降低,面條吸水性下降,蒸煮損失增加,這與楊雪紅[24]研究肌漿蛋白對豬肌原纖維蛋白凝膠特性的影響結果相一致。

圖10 MMBP添加量對MMBP-WP復合物凝膠微觀結構的影響

3 結論

MMBP能夠與小麥蛋白通過二硫鍵發生共價交聯使分子間發生不斷聚集形成凝膠網絡結構,從而增加MMBP-WP的凝膠強度、吸水性、保水性和熒光強度。此外,MMBP與小麥蛋白的相互作用大于小麥蛋白分子間的相互作用,因此添加MMBP能夠顯著增加小麥蛋白凝膠的黏彈性,使凝膠結構更加致密,對面筋結構起到支撐作用,從而有利于面條的彈性等蒸煮品質。添加6.0% MMBP可顯著改善面條的蒸煮品質和感官品質,添加6.0%的改性綠豆蛋白的MMBP-WP凝膠品質最佳。但是MMBP質量分數超過6.0%會影響凝膠與水分子間的作用,使MMBP與小麥蛋白間的交聯受到破壞,蛋白分子發生解聚和降解,凝膠結構發生斷裂,凝膠品質下降導致面條蒸煮品質降低。