幾種油脂添加量對發酵面團相互作用的影響

馬啟昱, 劉忠義, 付 滿, 龔受基

(北部灣大學北部灣特色海產品資源開發與高值化利用實驗室1,欽州 535011)

(廣西大學輕工與食品工程學院2,南寧 530004)

人們在快節奏高效率的生活中,對面制品的滿意標準日漸提升,以飽腹充饑的實效性為基點,追求營養全面、健康安全的高端品質,促使面制品行業產生競爭性刺激,提高制品整體質量。油脂是日常膳食中必需的營養組分之一,在食品領域中,因其重要的功能特性,用途廣泛,種類繁多。高質量的面制品在具有穩定貨架期的同時,要滿足適口性和營養性等大眾需求,而油脂的添加可顯著改良面團及其制品的食用品質。

國內外分析研究面團及面制品應用種類的涉及范圍較廣,脂類對面團及面制品品質的研究主要集中在油脂種類、添加量和固體脂肪含量等方面[1-3]。Moreira等[4]利用流變儀探究辣椒油、橄欖油和葵花籽油對栗子粉面團流變特性的影響,結果顯示,面團的表觀黏度和儲能模量隨油脂添加量的增大而降低,流變特性發生顯著性變化。Farmani等[5]研究發現添加質量分數為1%～2%的芝麻油可增強面團的混合耐受性,改善面團特性和微觀結構,提高面包的烘焙性能,降低變質速度,延長面包貨架期。Culetu等[6]調查了6種不同固體脂肪含量的油脂(黃油、人造黃油、豬油、棕櫚油、精制硬脂酸棕櫚油和氫化棕櫚油)對無麩質燕麥面團和餅干屬性的作用機理,認為油脂的固體脂肪含量是影響燕麥面團的熱性能、質構和流變特性的重要參數。

目前,面團工藝改良的研究多集中于因素對面團發酵特性、流變特性及感官品質的影響,較少涉及品質形成和變化的內在機理。而掌握油脂與面筋蛋白結合的調動作用可高品質地研發改良面團及其制品。因此,通過分析油脂與面筋蛋白結構的相關性,從微觀角度上考察油脂-蛋白構建體系,探討油脂添加量對面筋蛋白相互影響的內在機制,為面制品加工中油脂相關參數的改良提供基礎的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二胺四乙酸二鈉、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、尿素、亞硫酸鈉、氯化鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、溴化鉀、5,5′-二硫代2-硝基苯甲酸(DTNB)、福林酚試劑、1-苯胺基-8萘磺酸(ANS)等其他常見化學試劑均為分析純試劑;牛血清白蛋白(BSA),為分析標準品,純度≥96%。

1.2 儀器與設備

YH-6D發酵箱,SP Virtis臺式真空冷凍干燥機,800C多功能粉碎機,TG16MW高速離心機,T25高速勻漿機,XW-80A漩渦混勻器,HY-2多用調速振蕩器,紫外可見分光光度計,熒光分光光度計,傅里葉紅外光譜儀,Zeiss Sigma 300掃描電子顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 發酵面團的制備

向小麥原料粉中加入0.8%(小麥粉基)的酵母,混勻,將菜籽油、花生油、棕櫚油和奶油分別按照一定比例(4%、6%、8%、10%、12%)添加至小麥粉中,加入其他輔料,置于和面機中和面成團,對照組設置為未添加任何油樣的小麥面團。

1.3.2 面筋蛋白及面團粉末的制備

采用水洗法獲得定量面團中的面筋蛋白,將剩余面團與處理后的面筋蛋白同時置于-80 ℃的冰箱中速凍,真空冷凍干燥處理后分別破碎成粉末狀,以備后續實驗的取用。

1.3.3 持水性的測定

取0.5 g左右的樣品稱質量m1,移入離心管中稱質量m2,加入10 mL蒸餾水,渦旋振蕩1 min,高速分散均質,靜置30 min,4 000 r/min離心15 min,倒掉上清液,并用吸水紙吸干離心管內殘留的水分,稱質量m3,按式(1)計算持水性[7]。

(1)

1.3.4 游離巰基和二硫鍵的測定

參照袁德保等[8-10]的方法測定游離巰基和總巰基的含量,按式(2)計算二硫鍵的含量。

(2)

式中：SH總為總巰基含量/μmol/g ;SH游離為游離巰基含量/μmol/g。

1.3.5 化學作用力的測定

面團作用力的測定參照Gomez-Guillen等[11]的方法稍作修改。稱取1.0 g樣品,分別加入5 mL的0.05 mol/L氯化鈉(A)、0.6 mol/L氯化鈉(B)、0.6 mol/L氯化鈉+1.5 mol/L尿素(C)和0.6 mol/L氯化鈉+8 mol/L尿素(D)溶液混合,利用高速分散機均質30 s,在4 ℃條件下攪拌30 min,3 000 r/min冷凍離心15 min,測定上清液中蛋白質的濃度。其中離子鍵含量為蛋白質溶于B液和A液的濃度差值;氫鍵含量為蛋白質溶于C液和B 液的濃度差值;疏水相互作用含量為蛋白質溶于D液和C液的濃度差值。

1.3.6 表面疏水性的測定

采用ANS熒光探針法測定樣品表面疏水性。將1.0 g凍干樣品溶于磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)中,配制成質量濃度1 mg/mL的蛋白溶液。用磷酸鹽緩沖溶液稀釋成不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)的蛋白溶液。取稀釋樣液4 mL與8.0 mmol/L的ANS溶液20 μL混合,振蕩均勻,暗處理5 min,于10 min內測定熒光強度。激發和發射狹縫寬為5 nm,激發波長為370 nm,發射波長為480 nm。以熒光強度對蛋白濃度作圖并進行線性回歸,其斜率則為表面疏水性指數/H0。

1.3.7 紅外光譜分析

取凍干樣品與溴化鉀按1∶100的質量比研細混勻,壓片測定,光譜范圍4 000～500 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描32次,背景采集為空氣掃描。通過OMNIC軟件校正基線,對圖譜去卷積,利用PeakFit(v4.12)軟件對酰胺I帶區域(1 700～1 600 cm-1)譜圖進行二階求導擬合分析,確定各子峰面積,計算其二級結構的相對含量。

1.3.8 掃描電鏡對面團微觀結構的觀察

將速凍狀態的樣品切取1 cm3,經噴金處理后,置于觀察臺截面觀察并拍照。放大倍數500×;電壓20 kV。

1.4 數據處理

對樣品平行數據取平均值,采用IBM SPSS Statistics 25進行單因素方差分析(顯著性水平設定為P<0.05),OMNIC進行紅外光譜數據處理,PeakFit(v4.12)進行擬合圖分析,Origin2019b對數據作圖處理。

2 結果與討論

2.1 不同種類油脂及其添加量對持水性的影響

蛋白質持水性,是衡量食品保水能力的重要性質,對食品內部水分結合程度和蛋白結構穩定性起重要作用,間接體現蛋白質的功能特性。當樣品添加油脂后,由于油脂自身的潤滑保護作用,測定的持水性重點表征的是蛋白保水能力,其次反映較弱的吸水性。

圖1為不同油脂添加量對蛋白-淀粉-油脂復合體系持水性的影響。油脂的添加顯著增強復合體系的持水性,隨著添加量的增大,復合體系持水能力先提高后降低(P<0.05),未添加油脂時的持水性為0.866 g/g(面筋蛋白持水性為2.487 g/g),而棕櫚油、菜籽油和花生油質量分數為8%時,達到復合體系最大持水性,分別為0.971、1.096、0.943 g/g(面筋蛋白持水性為3.760、3.946、3.392 g/g);奶油質量分數為10%時,復合體系最大持水性為1.051 g/g(面筋蛋白持水性為3.968 g/g),同時也是4種油脂面團持水性能最好的樣品。

注：圖中同組數據上標有不同小寫字母a～d表示數據差異顯著(P<0.05)。圖1 油脂添加量對面團持水性的影響

少量的油脂提高持水性,一方面可能由于油脂加入面團,形成保護膜覆蓋在蛋白-淀粉網狀結構體表面,鎖住部分水分的流失,保水性能得到改善;另一方面,油脂可與蛋白質疏水基團相互結合,暴露極性氨基酸側鏈,加強蛋白的親水基團與淀粉等組分的水合作用,提高結合水比例,提高面筋蛋白吸水性。然而,非極性脂肪酸過度引入破壞交聯作用的互換平衡,疏水殘基過多,表面疏水性占據主導地位,分子間或分子內的氫鍵、離子鍵等斷裂,靜電作用和范德華力減弱,降低水的結合能力,持水性降低,從而影響面團的質地結構。

2.2 游離巰基和二硫鍵含量分析

在蛋白二級結構、超二級結構和結構域基礎上,蛋白質的三級結構是通過側鏈基團和化學作用力相互作用建立的高級空間構象,借助肽鏈上不同排布方式的原子組合來維系結構層次。其中,參與一級結構的二硫鍵也是形成高級蛋白構象的重要共價鍵,對面團三維結構的“搭建”起重要作用[12],是判斷面團內部結構穩定性的指標之一。

考慮到面團中淀粉組分的比例較高,對實驗考察對象的結果會產生一定的影響,因此選擇測定面團和面筋蛋白兩者中的游離巰基和二硫鍵含量進行比較分析。圖2為油脂添加量對游離巰基和二硫鍵的影響,從圖2可以看出,面團和面筋蛋白中的總巰基和二硫鍵含量隨油脂添加量的增大呈先增后減的趨勢,而游離巰基反之。樣品中位于半光氨酸殘基的游離巰基被氧化轉化為二硫鍵,二硫鍵相互結合形成麥谷蛋白聚合體,穩定面團內部結構[13]。添加適量油脂的面團中,油脂影響淀粉與蛋白等大分子間的接觸, 借助氫鍵、離子鍵等相互作用力共同構成面筋網絡結構, 破壞分子間和分子內巰基的平衡,內部巰基暴露增多,巰基總量增大;但油脂可增強面筋蛋白內部巰基的氧化程度和二硫鍵的交聯作用,導致游離巰基含量減少,二硫鍵含量增多,網絡結構緊密,面團的持氣能力提高,面團筋力得到改善。同時,面團和面筋蛋白的測定結果差異只存在于數值大小,但兩者趨勢基本一致,這從側面說明油脂添加量對面筋蛋白的游離巰基和二硫鍵含量產生相關影響,從而使面團的特性發生顯著性變化。

注：以縱軸參數為組別分析,不同小寫字母a～e表示數據差異顯著(P<0.05)。圖2 油脂添加量對游離巰基和二硫鍵含量的影響

適量添加各類油脂對面團結構穩定性均存在一定的促進作用,然而當油脂質量分數超過8%時,總巰基和二硫鍵含量隨油脂添加量增大而減少,但仍高于無油樣品的檢測值,由此推測可能是油脂添加過多導致油脂小分子大量聚集,淀粉-蛋白-油脂三元混合體相對減少,水合作用減弱,水溶氧分子含量的降低阻礙部分游離二硫鍵的形成,減弱面筋網絡結構的剛性,內部骨架松散,降低面團咀嚼性和膠著性。

通過油脂類別的橫向對比,油脂對二硫鍵轉化促進的作用程度排序為：奶油>棕櫚油>花生油>菜籽油。奶油的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例接近7∶3,棕櫚油的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例大致為1∶1,而菜籽油和花生油的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸比例接近趨近于2∶8,4種油脂的不飽和程度排序為：菜籽油>花生油>棕櫚油>奶油。根據結果可推測,飽和脂肪酸占比高的油脂或不飽和程度低的油脂對二硫鍵形成的促進作用更顯著。

2.3 面團內部化學作用力分析

由陰陽離子通過靜電作用相互轉移形成的化學鍵被稱為離子鍵,離子鍵在維持蛋白內部結構方面占重要作用[14]。以添加棕櫚油的面團樣品和面筋蛋白樣品為例,如圖3所示,添加油脂,面筋蛋白結構中的部分離子鍵發生斷裂,與有機大分子重組形成新的離子基團,使離子鍵種類和數量增多。利用水合作用改變初始結構,影響面團內部包裹氣泡的液膜,穩定面團的蛋白構象。面團中的水分子間或水分子與親水基團間均可形成氫鍵,且生成數目較多,利于改善面團的物理性質。油脂添加量與氫鍵含量呈正相關,氫鍵的飽和度導致部分水分子間的氫鍵結構被水分子與有機分子間的氫鍵所取代。添加適量的油脂,可提高結合水的含量,促進物質間的交聯作用,適度增強面團的“剛性”[15]。

在添加質量分數為4%的油脂時,疏水相互作用增強,而隨添加量的不斷增大,疏水相互作用逐漸減弱。疏水相互作用與游離巰基的氧化有一定的相關性[16],油脂初始添加量較低的面團具有較高的疏水作用值,這可能是因為少量的油脂零散雜亂地分布在面團中,油相與水相的分界面相對明顯,氧化游離巰基形成的二硫鍵含量較低,大分子締合能力偏弱,疏水相互作用增強;隨著油脂的繼續添加,二硫鍵含量顯著提高,大分子相互交聯的能力得到充分發揮,疏水作用相對減弱,面筋得到充分潤漲,有效地改善面團的彈性和延展性;當超過8%的油脂質量分數時,油脂阻礙水與面筋蛋白的有效接觸,疏水相互作用趨于穩定甚至出現增強的趨勢,開始抑制面筋的形成,降低面團筋力。因此,可考慮將8%的油脂質量分數作為面制品加工原料的優化參數。不同油脂間結果的比較分析,可發現各指標的優化數值差異不顯著,這可能是因為內部化學作用力是由油脂中多種組分共同作用的結果,4種油脂組分中的脂肪酸種類有交疊的部分,整體作用力間相互聯系,因而橫向比較,其實驗數據的差異不大。

2.4 表面疏水性分析

搭建三級結構的次級鍵通過相互作用影響面團的內部穩定性,其中采用ANS熒光探針法測定的蛋白質表面疏水性指標是表征蛋白質表面非共價作用的一個重要定量指標[17],反映面團內分子表面疏水性基團的相對含量,衡量蛋白質的變性程度,影響蛋白質的理化性質和結構特性。

由圖4可知,加入質量分數為4%的油脂時,非極性油脂被引入,少量脂肪酸進入蛋白質分子內,蛋白鏈間可能發生親水基團間的水合作用,而疏水基團間參與交聯作用較少,非極性混合體系中的蛋白分子無法聚合,疏水殘基外翻[18],累積含量增大,分子內結構因新組分的加入產生變化,部分基團暴露,提高表面疏水性。而隨著油脂添加量的增大,油脂可增強暴露疏水基團的聚集性,穩定液膜結構,包裹部分疏水性區域,從而導致面筋蛋白-油脂-淀粉復合體表面疏水性顯著降低。而過量的油脂會使面筋過度潤漲,面筋蛋白的肽鏈伸展程度增大,蛋白構象延展開放[19],破壞結合水等穩定結構,氨基酸側鏈的疏水性殘基脫離蛋白疏水性區域,暴露于表面,檢測熒光強度增強。綜合比較,可選擇8%的油脂添加量作為面團品質優化的參考值;通過油脂種類比較,認為奶油降低蛋白疏水性的強度高于其他3種植物油脂,說明奶油中的脂質顆粒結合面筋蛋白能力較高,油脂-蛋白結合構象穩定,內部基團的展開程度弱,表面疏水性的測定結果最低,推測這可能與奶油的固體脂肪指數有一定的相關性,通過其黏稠性賦予面團內部組分較強的吸附能力,促進網絡結構的形成和穩定。

注：不同小寫字母a～f表示數據差異顯著(P<0.05)。圖4 油脂添加量對表面疏水性的影響

2.5 紅外光譜分析

為進一步研究油脂的添加對面筋蛋白構象的影響,通過去卷積及二階求導方法對酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1) 的吸收峰進行擬合,分析面筋蛋白二級結構的相對含量,如表1所示。其中,蛋白酰胺Ⅰ帶吸收峰1 612～1 638 cm-1、1 681～1 690 cm-1為β-折疊,1 640～1 650 cm-1為無規卷曲,1 650～1 660 cm-1為α-螺旋,1 665～1 680 cm-1為β-轉角[21]。由表1可知,面團中二級結構主要以β-折疊和α-螺旋為主,其次為無規則卷曲和β-轉角。面筋蛋白中的氫鍵和二硫鍵可作用形成α-螺旋和β-折疊[22],穩定二級結構,增強面團的剛性特質。添加適量油脂后發現,無規則卷曲結構含量均顯著降低,說明部分無規則卷曲轉化為α-螺旋和β-折疊,即氫鍵與二硫鍵含量顯著增加,面團內部化學作用力分析實驗也證實油脂的添加會增加面團內部的氫鍵作用力,改善面團質構特性。因油脂自身組分的不同,添加不同油脂后,二級結構的含量在初始值上發生顯著的變化,而具體相關組分如何作用產生的影響有待后續進一步的探究和討論。

表1 面筋蛋白的二級結構

2.6 掃描電鏡對面團微觀結構的觀察

使用掃描電子顯微鏡在放大500倍數的條件下,觀察不同油脂不同質量分數(4%、6%、8%、10%、12%)的面團微觀結構。以棕櫚油面團和奶油面團內部結構為例,其電鏡圖像見圖5,油脂種類及其添加量可顯著影響面團的微觀結構,奶油和棕櫚油的影響差異明顯。但是棕櫚油、花生油和菜籽油的影響規律趨向一致。面團經過發酵產氣后,淀粉顆粒間出現大小不一的孔隙,面筋蛋白吸水形成不連續、不規則的絲狀基質,覆蓋在淀粉顆粒的表面,高聚合體相互交聯堆積成海綿狀網絡結構[23]。

圖5 添加不同質量分數油脂的面團掃描電鏡圖(500×)

添加少量油脂(質量分數為4%),面團內部結構中依然存在較大的空洞,基質呈現松散、不緊致的形態;隨著油脂添加量的增大,油脂的黏稠性提高淀粉顆粒的附著性,使其均勻鑲嵌于三維網狀結構間,促進淀粉-蛋白體系的交聯;油脂的潤漲性提高淀粉持水性和膨脹度,增強面筋的延展性;油脂的流動性,利于油脂均勻地滲透到面團內部,阻止有序面筋的雜亂黏結,穩定具有保護作用的液膜結構,提高面團的持氣性,降低電鏡觀察前速凍的損傷程度[24],縮小孔洞,提高均勻度和邊緣平滑度,構建相對完整且細密緊致的蛋白網絡結構,內部部分蛋白基質的排列方式趨向有序性。

面團的微觀結構隨油脂添加量的增大呈先優后劣的趨勢,過量添加油脂后,微觀結構表現效果降低。當質量分數大于10%時,油脂稀釋面團組分含量,過量疏水基團的引入降低分子間水合作用,減弱巰基的氧化作用和氫鍵等分子間作用力效果,阻礙分子聚合,呈現破壞連續面筋結構的趨勢,部分較大的淀粉顆粒開始外露散于表面,面筋基質的包裹能力降低,出現局部斷裂的情況[25],降低面團持氣能力和延展性。面團整體結構分布不穩定,緊密區和松散區雜亂存在[26],蛋白顆粒表面粗糙出現少許蜂窩狀裂孔,分離出少量細碎顆粒,面團氣孔增大數量增多,油脂凝集,三維網狀結構發生改變,面團彈性和延展性被破壞,感官品質降低。因此,適量油脂的添加可以改善發酵特性,穩定甚至促進面筋結構的形成,提高面團品質特性,這與Watanabe等[27]的研究結果相一致。

不同油脂面團微觀結構及其面筋網絡的形態差異顯著,奶油高添加量面團的微觀結構較其他3種植物油脂的結構細密,其原因可能是奶油中的短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸占比較高,與面筋蛋白結合的效果較好,細小均勻的油脂顆粒在面團空洞中發揮共聚和填充的作用;此外,奶油流動性較低,添加量較高時不易稀釋面團組分,流動分布且分散范圍可控,難以聚集形成油珠,使面團避免產生質地粗糙部分結塊的現象。

3 結論

采用菜籽油、花生油、棕櫚油和奶油揉制發酵面團,用單因素分析法,探究不同添加量條件下,油脂對面團作用機制的影響。結果表明,不同種類的油脂及其添加量對面團內部機制具有顯著影響,添加油脂會增加面團內部的氫鍵、離子鍵等化學作用力,氧化面團中的游離巰基,提高二硫鍵的含量;油脂的加入促進內部水分子與大分子物質交聯締合,增加面團內部結合水含量,提升蛋白質有序二級結構的比例,穩定面筋蛋白網絡構象。用掃描電鏡觀察發現,添加適量油脂(即植物油脂質量分數為8%,奶油質量分數為10%)時,面團的油脂與面筋蛋白均勻結合,結構緊密不空洞,效果顯著優于其他實驗面團。然而,油脂質量分數超過10%的面團內部結構出現松軟坍塌的趨勢,面筋網絡穩定性受到破壞,面團品質大幅度降低。因此,考慮面團的內部結構和食用品質,建議選擇8%作為菜籽油、花生油、棕櫚油的最適質量分數,8%～10%為奶油的最適質量分數。