芽孢桿菌復合菌劑降解玉米秸稈的性能研究

張 超 李曉意 楊 吉 孫金旭 高群英 王 茜 高小寬

（衡水學院生命科學學院 河北 衡水 053000）

河北省作為華北平原上的農業大省，主要種植小麥、玉米、高粱和谷子等農作物。因此，農作物秸稈分布廣、產量大，僅衡水市每年可收集秸稈量就為485 萬t，其中玉米秸稈276 萬t，約占秸稈總量的56.9%[1]。玉米等農作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素等植物細胞壁組成，該類組分都屬于有機碳水化合物大分子，是優質的可再生資源[2]。但因其結構致密、復雜，難以降解，導致利用率下降。因此，如何實現玉米秸稈的高效降解已成為當前研究的重點。

復合菌劑憑借自身豐富的秸稈降解酶系和菌株間相互協同促進的降解作用，成為農作物秸稈的重要研究方向。梅新蘭等[3]通過構建細菌- 真菌復合菌劑，使水稻秸稈的降解率以及纖維素酶活顯著提高。江高飛等[4]研究真菌復合菌系降解玉米秸稈發現，降解菌多樣性的增加有助于增強秸稈的降解效果。本研究利用實驗室保存的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢桿菌(Bacil-lus lincheniformis)構建復合菌劑，研究其對玉米秸稈的降解性能，為高效降解秸稈提供菌株資源和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。玉米秸稈采集于衡水市深州農田，洗凈、晾干，粉碎后過30 目篩。枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)和地衣芽孢桿菌(Bacillus lincheniformis)保存于本實驗室。

1.2 培養基配方。LB 培養基[5]。玉米秸稈降解培養基：蛋白胨5.0 g/L、(NH4)2SO42 g/L、MgSO40.5 g/L、K2HPO41 g/L、NaCl 0.5 g/L、玉米秸稈粉50 g/L、pH值7.0、121 ℃高溫滅菌20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 芽孢桿菌種子液的制備。用無菌槍頭挑取3 種芽孢桿菌的單菌落，分別接入含100 ml LB 培養基的三角燒瓶中，轉移至恒溫培養箱，37 ℃、180 r/min震蕩培養24 h。

1.3.2 單菌株和復合菌劑降解玉米秸稈方法。收集種子液，10 000 r/min 離心，棄上清，菌體沉淀用無菌生理鹽水分別制備含枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的菌懸液，使菌體濃度達到1 ×109CFU/ml。按5%接種量將3 種芽孢桿菌的菌懸液分別接入100 ml 玉米秸稈降解培養基中，形成單菌株玉米秸稈降解體系；將3 種芽孢桿菌的菌懸液按1∶1∶1的比例，5%的接種量接入玉米秸稈降解培養基，形成復合菌劑玉米秸稈降解體系。2 種體系均在25 ℃、100 r/min 的條件下發酵培養15 d。試驗設3 個重復。

1.3.3 纖維素酶活的測定。酶活測定包括羧甲基纖維素酶活(CMCase)和濾紙(FPA)酶活測定，具體方法如下：取發酵完成后的培養液，10 000 r/min 離心后取上清即為粗酶液，采用DNS 法[6]，以1 ml 1%CMC-Na 和100 mg 濾紙為底物，分別與1 ml 粗酶液完成反應。酶活力單位(U)定義為：在上述條件下每分鐘催化底物生成1 μmol 還原糖所需酶量為1 個活力單位。

1.3.4 玉米秸稈降解率的測定。采用失重法評估玉米秸稈的降解效果，具體方法如下：將發酵完成后的玉米秸稈粉用濾紙過濾，蒸餾水反復清洗，105 ℃烘干8 h，稱重，按以下公式計算降解率。

公式中w0為對照玉米秸稈粉干重，mg；w為降解后玉米秸稈粉干重，mg。

1.3.5 統計分析。數據處理采用Graph Prism 7.0 軟件進行分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 3 株芽孢桿菌和復合菌劑的纖維素酶活評價。由圖1 可知，3 株芽孢桿菌單菌株CMCase 活性相差較大，其中地衣芽孢桿菌的活性最高，達到39.290 ±2.499 U/ml，枯草芽孢桿菌次之，酶活為 37.458 ±1.335 U/ml，貝萊斯芽孢桿菌的酶活最低，僅 為 28.066 ±4.703 U/ml。而復合菌劑的CMCase活性較單菌株有顯著提升，達到113.522 ±5.528 U/ml；3 株芽孢桿菌的FPA 活性從大到小依次為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，酶活分別為13.961 ±1.493 U/ml、11.153 ±1.746 U/ml和9.375 ± 0.441 U/ml，而復合菌劑的FPA 則高達29.851±3.061 U/ml。上述結果表明，與單菌株相比，復合菌劑纖維素酶活大幅提升，表現出明顯的菌株間協同促進作用。

圖1 單菌株與復合菌劑的纖維素酶活

2.2 株芽孢桿菌和復合菌劑的秸稈降解效果評價。以玉米秸稈粉為試驗材料，經單菌株和復合菌劑15 d發酵降解后，過濾、洗滌、烘干和稱重，計算降解率，結果如圖2 所示，單菌株的降解率均低于40%，其中貝萊斯芽孢桿菌的降解率最高，達到36.53%，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的降解率分別為20.04%和28.49%，而復合菌劑的玉米秸稈降解率為72.47%，顯著高于上述單菌株降解率。

圖2 單菌株和復合菌劑的秸稈降解率

3 結論與討論

芽孢桿菌屬細菌種類豐富，且大多能分泌纖維素酶，用于玉米秸稈的降解可取得較好的降解效果，如林源等[7]利用1 株枯草芽孢桿菌產生的纖維素酶，降解玉米秸稈發酵生產乙偶姻用于造紙。倪志華等[8]使用1 株凝結芽孢桿菌發酵酸解玉米秸稈用于乳酸生產。本研究選擇前期篩選的秸稈降解菌株，即枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌構建復合菌劑，經15 d 發酵降解玉米秸稈，測得纖維素酶活，如CMCase 為113.522 ±5.528 U/ml 和FPA 為29.851 ±3.061 U/ml，秸稈降解率高達72.47%，顯著優于單菌株降解效果，這為秸稈降解復合菌劑的開發提供了參考。