一例長頸鹿支原體感染的診斷

何松，湯德元，毛茵茗，周飄，廖正波，袁盛林，陳旭

（貴州大學動物科學學院，貴州貴陽 550025）

支原體又稱霉形體，天然無細胞壁，細胞柔軟，高度多形性，其大小介于細菌和病毒之間，具有三層膜結構，可通過200～450 納米孔徑的濾膜，以二分裂方式生長繁殖，在液體或固體培養基中生長較慢，一般在5%CO2細菌培養箱中培養3～7 天，染色其形狀呈典型的“油煎蛋”樣，革蘭氏染色陰性但著色效果不佳，姬姆薩染色良好。支原體于1961 年在美國首次于病?；加腥橄傺椎牟×现蟹蛛x出，我國在1983 年首次在患有牛乳腺炎的牛奶中分離到牛支原體。目前，支原體廣泛分布于自然界，許多動物都有感染，已經發現了近200 種。支原體在避免陽光直射條件下可存活數周，在4℃牛乳和海綿中可存活2 個月之久，在水中可存活2 周以上，但支原體一般不耐高溫，在65℃經2 分鐘、70℃經1 分鐘即可失活，但在4℃～37℃液體介質中的存活力不受影響，可以存活半年之久。支原體能夠引起動物呼吸系統疾病、關節炎、乳腺炎或角膜結膜炎等癥狀，給世界相關養殖戶帶來了嚴重的經濟損失。

長頸鹿是一種生長在非洲稀樹草原地帶以樹葉及小樹枝為主食的反芻偶蹄動物，隸屬于哺乳綱長頸鹿科，是世界上現存最高的陸生動物,牙齒為原始的低冠齒, 舌長且靈活, 具短角, 角上被有毛的皮膚覆蓋。成年長頸鹿高4～6 米，體重600～900 千克，是當前最具觀賞性的陸生動物。羅琴等人調查了廣州市某野生動物園草食類及靈長類野生動物腸道寄生蟲的感染情況，他們采用糞便檢查法共檢查36 種動物500 份糞樣，總陽性率達到了50.6%，其中長頸鹿、角馬、彎角劍羚樣品多為混合感染，表明長頸鹿等野生動物被一些寄生蟲及微生物混合感染較為普遍。在本病例中，我們發現貴州森林野生動物園一只長頸鹿發病死亡，其臨床癥狀表現為精神沉郁、消瘦、食欲下降和呼吸困難，病程大約一個星期，根據其臨床癥狀疑似支原體感染，隨后我們采集其心臟、肺臟和肝臟等病變組織進行實驗室診斷，以期從樣品病料中找到長頸鹿死亡原因，為今后更好保護長頸鹿預防支原體感染提供參考。

1 臨床癥狀

長頸鹿的發病臨床癥狀為消瘦、食欲下降、呼吸急促、頻率60 次/分鐘，體溫升高達40.3℃，病程大約一個星期，對死亡長頸鹿進行剖檢發現：肺有壞死點，心臟有大量的心包積液。采集病變樣品：心包積液、肝臟和肺臟進行實驗室診斷。

2 實驗室診斷

2.1 細菌鏡檢

對送檢長頸鹿心組織、肝組織、肺組織進行革蘭氏染色：初染，滴加結晶紫，染色1～2 分鐘，水洗；媒染，用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1分鐘，水洗；脫色，用濾紙吸取或甩去載玻片上的殘水，將載玻片傾斜，在白色背景下，用滴管滴加95%乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時（20～30秒），立即水洗；復染，用藩紅復染約2 分鐘，水洗；鏡檢，用濾紙吸水，干燥后，顯微鏡油鏡觀察。鏡下檢查結果顯示：有少許革蘭氏陰性菌。

2.2 細菌分離培養

無菌操作從死亡的長頸鹿的肺組織﹑心臟組織和肝組織取樣分別劃線接種于需氧及厭氧的血清LB 培養基培和麥康凱培養基上，37℃恒溫箱培養24～48 小時，LB 培養基和麥康凱培養基上未見細菌生長。

2.3 支原體PCR 檢測

病死長頸鹿的肺部等剖檢病變不能作為診斷的依據, 必須采用實驗室診斷以進行確診，取肺組織﹑心臟組織和肝組織各一小塊置于研缽中碾碎，再用勻漿機打碎組織，打碎組織后反復凍融3 次，取上清100 微升，加入200 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，渦旋振蕩15 秒，56℃孵育10 分鐘。實驗室保存的陽性病料處理：取陽性對照100 微升，加入20 微升蛋白酶K，再加入200 微升溶液AL，渦旋振蕩15 秒，56℃孵育10 分鐘，之后按照支原體DNA 的提取試劑盒要求提取DNA。PCR 擴增每份總體積25 微升，2微升Taq DNA 聚合酶，2 微升模板DNA，2 微升引物，最后加ddH2O 到25 微升。在PCR 擴增儀上進行擴增程序：94℃預變性3 分鐘、94℃變性30 秒、50℃退火30 秒、72℃延伸45 秒，共35 次，最后72℃延伸10 分鐘。反應結束后取7 微升PCR 產物進行瓊脂糖凝膠中電泳檢測，用凝膠成像系統拍照記錄。其結果中檢測出支原體特異性陽性條帶，結合前面的臨床癥狀和診斷，表明長頸鹿死于支原體感染。

3 討論

本研究通過對死亡長頸鹿的相關臟器進行細菌培養及PCR 鑒定，從肺臟和心臟中檢測出支原體特異性陽性條帶，結合臨床癥狀及實驗室診斷綜合分析，診斷為支原體感染引起的肺炎和心肌炎造成長頸鹿死亡。支原體感染往往并不導致直接致命的損傷，而是通過長期持續的感染，誘發機體發生免疫損傷和凋亡而導致病變及續發感染，進而導致患病動物的死亡。肺炎支原體致病菌株在肺組織中具有很強的生長繁殖能力，能引起肺部炎癥，并誘發嚴重的續發感染，從而導致感染動物死亡。本病例中長頸鹿感染支原體而死亡，為長頸鹿支原體病防控敲響了警鐘。

圖 支原體PCR 擴增結果

國內動物園關于長頸鹿支原體感染的病例報道很少，如果日常飼養管理中觀察不夠細致，極有可能延誤最佳治療期，導致病情加重而死亡。由于支原體沒有細胞壁，因此對青霉素和頭孢類藥物不敏感，用來治療支原體的感染其效果不佳；而支原體對環丙沙星、四環素、泰樂菌素、泰妙菌素等抗菌藥物較為敏感，可以對支原體的感染起到一定的治療作用，但不同藥物其臨床效果存在一定的差異，這可能與感染動物的抵抗力、支原體的耐藥性及繼發感染等因素有一定的關系。支原體病的發生與環境、天氣、喂食、飲水、管理等因素有關，因此本病的防制不能完全依賴抗生素和疫苗，而應采取綜合性防制措施，同時加強環境的消毒和改善飼養管理條件。近期有人評估了不同濃度的檸檬酸和次氯酸鈉對支原體的消毒效果，結果發現，在有機物質存在條件下，0.5%檸檬酸和1%次氯酸鈉能使支原體的活力顯著降低，達到了預期的消毒效果，為長頸鹿圈舍消毒提供了參考。在本案例中其他長頸鹿也出現了征兆明顯的臨床癥狀，隨后采集其血液進行支原體抗體檢測，檢測出支原體抗體，同時通過使用阿奇霉素類藥物進行治療并清潔環境衛生，效果明顯，這為長頸鹿感染支原體的防制提供了參考。