甜葉菊提取物對高糖脂飲食鼠血脂及其腸道菌群的影響

陳敏,尹明雨*,趙一夢,王錫昌

1(上海海洋大學 食品學院,上海,201306)2(復旦大學 人類表型組研究院,上海,200438)

肥胖現已成為繼吸煙、艾滋病之后的第三位影響人類健康的流行病學因素,且位居全球第五大死亡原因[1]。肥胖不僅與糖尿病、高血壓、冠狀動脈心臟病、高血脂、腦卒中、關節炎等多種慢性疾病密切相關,同時又是許多慢性非傳染性疾病的危險因素[2]。肥胖的發生與脂質代謝密切相關,當機體能量攝入與支出失衡時,脂肪組織將過剩營養以甘油三酯的形式貯存在脂肪組織中,導致脂肪細胞數量的過度增加、細胞體積的過度增大,甚至導致脂肪細胞凋亡或壞死,進而導致脂肪過度堆積和(或)分布異常的病理狀態[3-4]。另一方面,由于能量攝入與消耗的不平衡使機體能量系統出現應激反應,導致腸道代謝生態系統的變化[5]。近年來大量研究證實,腸道菌群失調能夠改變腸道通透性[6],使大量游離脂肪酸進入肝臟導致肝內大量脂質沉積[7],誘導肝細胞氧化損傷,促進慢性疾病的發生發展[5]。

腸道微生物群能夠影響腸道內物質的吸收、能量代謝,免疫器官發育和抵抗病原體等生理過程,在生命活動中發揮著至關重要的作用[8]。腸道內脂肪營養源微生物分解攝入的外源食物時,當脂質含量超過機體所需量,會被進一步貯存進而直接或間接導致肥胖[2]。這一生理過程會改變血清、脂肪組織和肝臟中的脂質代謝產物來影響甘油三酯、磷脂酰膽堿和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFA)的代謝,從而間接影響能量和脂質代謝[9]。越來越多的證據還表明,肥胖相關微生物可以改變宿主能量獲取、胰島素抵抗、體內平衡和脂肪沉積。SCFA、γ-氨基丁酸、膽汁酸和5-羥色胺,是一類典型的腸道菌代謝產物,這些物質可通過免疫系統、腸-腦神經系統和全身循環傳播到中樞神經系統。然后,這些信號涉及各種傳入和傳出通路,如迷走神經和下丘腦-肝/脂肪組織軸,以調節穩態的各個方面。因此,調節腸道微生物群可能會改善肥胖相關疾病,例如調節脂肪積累和脂質代謝。除了通過體育鍛煉以及控制飲食量調節腸道菌群的熱量外,還可以服用幾種藥物,最常用的是雙歧桿菌[10]、乳酸菌和復合嗜酸乳桿菌[11],但大多數需要控制飲食。近幾年越來越多的研究發現富含多酚的食物具有抗氧化、抗腫瘤以及改善腸道微生物組成的功效[12-16]。因此,從天然植物中開發安全性、功能性的食品來調節腸道菌群結構和脂質代謝具有重要意義。

甜葉菊是多年生草本植物,于慧等[17]發現甜葉菊提取物(stevia extract, STE)具有良好的抗氧化活性,可有效抑制魚油、鮐魚松的氧化。李丹等[18]、任曉靜等[19]發現STE對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑菌作用。本課題組前期經過高場核磁共振以及液相串聯三重四級桿質譜儀檢測確定,STE中主要物質為香草醛酸4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、原兒茶酸、咖啡酸、綠原酸和隱綠原酸?；诖?本研究通過構建脂代謝紊亂模型,研究STE對高脂血癥鼠糖脂代謝、氧化應激和腸道微生態的影響。本研究對于甜葉菊類保健食品的開發具有重要意義,為甜葉菊高值高質化利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

甜葉菊提取物STE(維科制劑),上海維丘康敬生物有限公司;體重20～25 g,36只SPF級昆明小鼠,上海杰斯捷生物有限公司;基礎飼料,南京盛民生物有限公司;Qubit3.0 DNA檢測試劑盒,Life生物有限公司;除特殊說明外,本實驗中所使用的試劑盒均購自南京建成生物有限公司;乙醚,源葉生物工程有限公司。

Pico-21臺式離心機,Thermo Fisher公司;DYY-6C電泳儀,北京市六一儀器廠;PCR儀,北京東勝創新生物科技有限公司;酶標儀,美國 Molecular Devices公司;GA-3型血糖儀,三諾生物傳感有限公司。

1.2 實驗動物與飼料

將昆明鼠分別單獨飼養于塑料籠具中,飼養環境為溫度(23±2) ℃、相對濕度(50±10)%、明暗周期12 h。飼料及水均為自由攝取,籠具及墊料定期清洗更換,適應性喂養7 d后,分為3組(對照組,模型組,制劑組),各組體重無顯著性差異(圖1)。對照組:繼續飼喂標準飲食20 d后,每天灌胃0.4 mL無菌水,標準飼料及水均為自由攝取30 d;模型組:高脂高糖飲食20 d后,每天灌胃0.4 mL無菌水,高脂高糖飼料及水均為自由攝取30 d;制劑組:模型組高脂高糖飲食20 d后,每天灌胃0.4 mL STE制劑(按制劑干基0.05 g/kg比例將相應量制劑稀釋在0.4 mL無菌水內),高脂高糖飼料及水均為自由攝取30 d。其中每天灌胃的時間為18:00～19:00,每3 d稱量1次鼠體重并調整灌胃制劑量。試驗結束后,禁食不禁水12 h,采用乙醚麻醉。眼眶取血漿,后在室溫下靜置20 min,在4 000 r/min,4 ℃條件下離心15 min,取上層血清,置于-80 ℃冰箱。快速解剖出肝臟、腎臟、腹部脂肪、結腸,稱量,其中肝臟和結腸部位剪切一部分放入固定液,用于后續病理分析,其余全部分裝放入-80 ℃冰箱用于后續分析。

圖1 實驗示意圖Fig.1 Experimental scheme

1.3 生理生化指標的測定

參考試劑盒說明書,分別檢測血清中總膽固醇(total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol, HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol, LDL)和游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)。參考試劑盒說明書,檢測肝臟中TC、TG的含量。使用血糖儀測定鼠血糖情況,待儀器數值穩定后,讀取數值并記錄動脈硬化指數(atherogenic index, AI),計算如公式(1)所示:

(1)

1.4 氧化應激及轉氨酶水平測定

參考試劑盒說明書,分別檢測血清中谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。

1.5 組織切片

將肝臟和結腸組織浸泡在固定液中24 h后,使用蒸餾水反復清洗。按照濃度由低到高原則依次用60%,70%,80%,90%,100%(體積分數)乙醇進行梯度脫水。之后按照試劑盒對所得切片進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,H&E)染色,使用生物顯微鏡觀察并拍照。

1.6 腸道內容物水分的測定

使用快速水分測定儀測定結腸內容物水分含量。

1.7 小鼠糞便中腸道菌群的16S rRNA V3～V4區測序

試驗結束前,采用刺激外周肛門將采集到的糞便立即放在無菌離心管內,立即使用天根試劑盒提取總DNA。引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)用于擴增活性 16S rDNA的V3～V4區域。從2%瓊脂糖凝膠中提取擴增子,使用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒進行純化和定量,然后在生工生物工程有限公司使用FLASH (v.1.2.7)對原始讀數進行分析和質量過濾。使用UCLUST (v.5.2.236)對序列進行聚類,并根據97%成對同一性的閾值分配給相同的操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)。使用QIIME (v.1.8.0)計算Shannon和Simpson多樣性指數,以及Chao1和ACE豐度指數來分析alpha多樣性。QIIME軟件用于分析腸道菌群的組成和豐度,識別腸道菌群的結構變化。隨后得到樣本物種豐富度以及菌群多樣性等信息,并進一步比較分析不同分組其糞便微生物結構和功能的差異。

1.8 數據統計分析

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析,方差分析采用ANOVA分析,數據進行正態分布檢驗,符合正態分布的多重比較采用Duncan法,不符合正態分布的采用Kruskal-Wallis檢驗,P<0.05,差異顯著。作圖采用軟件Prism 9.0軟件(Graph Pad)繪制,數據以Mean±SD表示。

2 結果與分析

2.1 體重及臟器指數的影響

脂肪過度攝入會促使體脂在各個部位堆積,因此本文考察體重及幾個主要臟器的質量。從圖2可以看出,模型組體重,肝臟、附睪脂肪質量顯著高于對照組(P<0.05),但是對腎臟幾乎無影響(P>0.05)。STE制劑組的腹部脂肪顯著低于模型組(P<0.05),這也意味著STE制劑能夠促進昆明鼠脂質的代謝,抑制其脂肪過度貯存。肝臟是脂質的主要代謝器官,當機體攝入過多的脂肪,脂質分解代謝速率低于脂肪合成速率致使脂質在肝臟的堆積[4],肝葉肥大[7],STE可以抑制脂質在肝臟的堆積。血糖來源主要有兩種:一是食物中的糖類、蛋白質、脂肪[12];二是自身存儲的肝糖原和肌糖原[14],當血糖含量過高時會引起胰島素抵抗[20]。模型組由于攝入高脂高糖飲食,其血糖濃度極顯著高于對照組(P<0.001)。STE的干預顯著降低血糖濃度(P<0.05)。通過這些結果,我們可以證明甜葉菊提取物可以有效的抑制高脂高糖飲食帶來的體重增加和血糖升高。

A-小鼠體照片;B-體重;C-肝臟質量;D-腎臟質量;E-腹部脂肪質量;F-血糖圖2 昆明鼠體重,臟器質量及血糖變化Fig.2 Changes in body weight, organ mass and blood sugar of Kunming rat注:不同小寫字母表示樣品組之間存在顯著差異(P< 0.05)(下同)

2.2 脂質代謝的影響

血脂四項(TG、TC、HDL和LDL)水平反應了機體脂代謝水平正常與否[8]。由圖3可知,高脂高糖飲食導致血清和肝臟中TG和TC的含量極顯著增加(P<0.001)。STE可以顯著降低血清和肝臟重TG和TC含量(P<0.05)。STE可以顯著抑制由高脂高糖飲食帶來的HDL升高和LDL降低(P<0.05)。血清中游離脂肪酸含量和AI指數也可以側面反映血脂代謝情況[21],高脂高糖飲食極其顯著的提高血清FFA含量和AI指數(P<0.001),STE能夠極顯著的降低FFA含量(P<0.001),這一結果與上文表型結果相一致。STE能影響高脂高糖膳食飼喂小鼠的脂代謝水平。

A-血清TG含量;B-血清TC含量;C-肝臟TG含量;D-肝臟TC含量;E-游離脂肪酸含量;F-血清HDL含量;G-血清LDL含量;H-AI指數圖3 昆明鼠血清及肝臟中脂質代謝產物的含量Fig.3 Contents of lipid metabolites in serum and liver of Kunming mice

2.3 氧化應激狀態

氧化應激是指生物體內氧化與抗氧化系統紊亂引起活性氧自由基積累,而活性氧自由基可以與細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化作用(產生中間產物MDA),導致組織及器官氧化損傷[2,13,22]。大量研究表明高脂高糖飲食可以誘導機體氧化應激[23]。SOD是生物體內最重要且最佳的自由基清除劑,維持機體代謝平衡。谷胱甘肽過氧化物酶可以催化谷胱甘肽產生氧化型谷胱甘肽,是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶[15]。本研究發現高脂高糖飲食降低了血清中GSH-Px和SOD水平,提高了MDA的含量,這可能是由于血清中脂質的過氧化產生MDA,誘導GSH-Px和SOD的消耗。相對于模型組,STE能夠顯著的提高GSH-Px和SOD水平(P<0.05),同時降低MDA的含量促使其恢復正常水平(P<0.05)(圖4)。有研究表明在應激狀態下機體血糖會大量分解提供熱量和功能,因此氧化應激的改變也促進了血糖的改變,這一結果與上文一致。這里可以得出STE干預顯著改善了高脂高糖飲食引起的氧化應激狀態。

A-SOD;B-MDA;C-GSH-Px圖4 昆明鼠血清中氧化應激的變化Fig.4 Changes of oxidative stress in serum of Kunming mice

2.4 肝臟損傷情況

高脂高糖飲食誘導脂質代謝紊亂,肝臟代謝功能是否正常需要被確認,如圖5所示,測定血清中ALT和AST水平。結果顯示高脂高糖飲食組血清ALT和AST水平極其顯著高于標準飲食鼠(P<0.001),STE能夠顯著抑制轉氨酶的升高(P<0.01),表明STE能夠保護肝臟,維持正常的肝臟脂代謝功能。對肝臟組織進行H&E染色發現,模型組和制劑組與對照組相比肝臟脂滴明顯增多,脂質積累明顯增加。相對于模型組,制劑組肝臟脂質小而少,這一結果與血脂情況以及轉氨酶結果相一致。證明STE能夠調節脂代謝,保護肝臟組織。

A-ALT;B-AST;C-肝臟H&E染色切片圖5 昆明鼠轉氨酶水平及肝臟組織形態學觀察Fig.5 The level of transaminase and histomorphology observation of liver in Kunming mice

2.5 結腸損傷情況

結腸是腸道消化食物中的重要部位。從圖6可以看出模型組結腸長度比對照組短(P<0.05),制劑組能夠抑制高脂高糖飲食引起的結腸變短。絨毛長度和隱窩深度是評價腸道消化性能的直觀指標,腸道絨毛越長,隱窩越淺,絨毛長度和隱窩深度的比值越大,代表消化吸收能力越好,反之消化吸收能力較差[24]。結腸H&E染色切片顯示,長時間的高脂高糖飲食飼喂顯著改善了小鼠腸道的形態結構,模型組小鼠腸道絨毛明顯變短、隱窩顯著加深,說明高脂膳食對小鼠腸道的消化吸收能力存在影響。制劑組和模型組相比,腸絨毛長度增加,隱窩深度減小,并且可以看出制劑組腸道形態幾乎和對照組相似。腸道內容物水分含量能側面反映腸道的消化能力,水分含量較高促進食物在腸道內的蠕動促進消化,通過檢測發現,制劑組的水分含量都較高,與對照組無顯著差異(P>0.05),顯著高于模型組(P<0.05)。上述結果表明STE的添加對高脂高糖飲食引起的小鼠腸道消化吸收能力、形態結構的改變有一定的改善作用。

A-結腸圖片;B-結腸長度;C-腸道內容物水分含量;D-結腸H&E染色照片圖6 昆明鼠結腸組織學評估Fig.6 Histological evaluation of the intestines of Kunming mice

2.6 腸道菌群結構

越來越多的研究表明腸道微生物與宿主對營養物質和能量的攝取[7]、糖代謝和膽固醇代謝[12]、胰島素敏感性[22]、非酒精性脂肪肝[20]和慢性炎癥[25]等有關。在本研究中,利用Illumina Miseq高通量測序平臺測定小鼠腸道微生物16S rDNA的V3～V4區的序列來研究高糖高脂飲食和STE對小鼠腸道微生物的影響。腸道內微生物的多樣性決定著腸道微生態,可以用Chao1指數以及Simpson指數衡量腸道微生物多樣性[26]。從圖7-A～圖7-C可以看出,高糖高脂飲食以及STE對腸道微生物多樣性產生影響。主成分分析顯示,制劑組與對照組接近,與模型組較遠,這也說明制劑組腸道菌群結構與對照組相似。從腸道菌門水平上看,小鼠的腸道菌群主要由厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)組成。厚壁菌門微生物對食物中的熱量敏感,促進熱量的吸收,豐度過高,會引起肥胖。高脂膳食飼喂顯著增加了厚壁菌門的豐度(P<0.05),STE的干預顯著改善了高脂高糖飲食引起的這一變化。和模型組相比,制劑組擬桿菌門豐度顯著增加,從而導致厚壁菌門/擬桿菌門(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)的比值降低。以上結果可以說明STE干預可以將高糖高脂導致的紊亂腸道微生物組成逐漸向正常狀態移動。研究還發現STE的添加還可以提高乳酸桿菌屬的豐度。通過功能注釋分析發現,高脂高糖飲食影響著腸道脂代謝與糖代謝、信號傳遞通路、氨基酸轉運與代謝通路。

A-Chao 1指數;B-Simpson指數;C-腸道菌門水平;D-主成分分析;E-厚壁菌門/擬桿菌門比值;F-差異菌群豐度分析;G-熱圖分析圖7 甜葉菊提取物對昆明鼠腸道微生物的影響Fig.7 Effects of stevia extract on intestinal microbes of Kunming rats

為了探討腸道微生物與糖脂代謝以及氧化應激之間的關系,本文就腸道菌群的豐度與相關指標進行相關性分析[27],AI指數與Stenotrophomonas、Ruminococaceae、Odoribacter和Acetatifactor這些菌水平呈現顯著正相關。值得關注的是HDL含量、SOD、GSH-Px活性與影響SCFA合成的Prevotellaceae、抑制脂多糖產生的Akkermansia豐度顯著正相關。SCFA是腸道能量物質,較多的SCFA促進腸道微生物活動,SCFA的缺乏減弱了其對于腸道黏膜屏障的保護作用[28];脂多糖是一種腸源性內毒素,含量過高會破壞腸道黏膜屏障[29]。TG,TC,LDL,AST以及ALT與Rothia菌呈現顯著正相關。根據這些結果,推測STE的干預通過提高Prevotellaceae與Akkermansia的豐度,促使SCFA的產生增強腸道黏膜屏障的保護作用,降低腸源性內毒素脂多糖產生,維持腸道穩態,進而通過肝-腸軸作用調節血脂代謝,維持各部位脂質的平穩,保護肝臟。

3 結論

本研究使用高糖高脂飲食構建脂代謝紊亂模型,通過甜葉菊提取物干預高脂飲食鼠發現STE可以有效的抑制高脂高糖飲食帶來的體重增加和血糖升高,同時調節脂質代謝,維持氧化應激平衡,抑制肝臟脂質堆積;另一方面STE可以改善腸道結腸形態促進食物的消化吸收,調節腸道厚壁菌和擬桿菌的豐度。相關性分析表明HDL、SOD、GSH-Px與Prevotellaceae、Akkermansia相對豐度顯著正相關。本研究的發現為利用甜葉菊及其副產物改善脂代謝紊亂提供了新理論依據,同時為甜葉菊高值化利用提供了新思路。