醬香型白酒不同輪次發酵優勢細菌與主要差異代謝產物關聯分析

劉宏基,余有貴*,伍強,張旭,萬勇,熊翔,楊志龍,譚文君

1(邵陽學院 食品與化學工程學院,湖南 邵陽,422000) 2(生態釀酒新技術與應用湖南省高校重點實驗室,湖南 邵陽,422000)3(湖南湘窖酒業有限公司,湖南 邵陽,422000)

醬香型白酒是以高粱、小麥、水等為原料,經傳統固態法發酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的,未添加食用酒精及非白酒發酵產生的呈香呈味呈色物質,具有醬香風格的白酒[1]。醬香型白酒生產工藝獨特,具有高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵、高溫餾酒、生產周期長、貯存時間長、用曲量大、輪次多的“四高兩長一大一多”工藝特點[2]。醬香型白酒發酵工藝包括堆積發酵和窖池發酵兩部分。高溫堆積發酵是一個好氧發酵過程,是大曲醬香白酒生產環節當中必不可少的一個關鍵工序,它既要滿足糖化功能的形成,又要滿足發酵力的生成,還要達到香味物質的形成條件,直接影響產品的質量與產量[3]。窖池發酵是封閉式無氧發酵,醬酒醅在窖池內發酵時的溫度最高可達40～48 ℃[4],相比于濃香型白酒和清香型白酒的發酵溫度要高出很多。窖池高溫發酵是為酒精的生成和醬香物質的最后形成提供合適的發酵環境,發酵的作用是將糖轉化成酒,并且使香氣物質伴酒而生,形成大曲醬香酒特有的香味和風格。近年來,有關醬香酒發酵微生物與風味物質的報道很多,例如吳成等[5]對醬香型白酒四輪次堆積發酵進行風味物質與微生物群落的相關性分析發現,酵母菌主要與醇類物質呈正相關,細菌主要與酸類和酯類物質呈正相關;麻穎垚等[6]運用宏基因組學分析醬香型白酒窖內發酵優勢菌與代謝功能的相關性發現發酵后與發酵前相比,醇、酸類物質含量明顯增加,酯類物質種類豐富,判斷窖內發酵階段菌群的主要代謝功能為碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

湖南邵陽四面環山,中間為丘陵盆地,森林覆蓋率高,空氣流動慢,資江自西南向東北流貫全境,雨熱同季,獨特的自然環境和氣候條件造就了獨特的微生物區系,在這個特定的環境下所釀造出的醬香型白酒口感特征明顯,第三輪次酒醇甜,第五輪次酒帶焦苦味。細菌產香,酵母產酒,探究湘產醬香型白酒不同輪次發酵優勢細菌屬與酵母代謝通路上具有風味特征的物質的相互關系,更能體現優勢細菌屬的功能所在,對揭示湘產醬香酒與貴州核心產區醬香酒相比口感有細微差異的原因更有幫助,具有明顯的地方特色。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 酒醅樣品

30個樣品均采自湖南湘窖酒業有限公司醬酒車間二班組。堆積酒醅樣品從堆積結束后取樣,每個樣品為平行堆子上、中、下層酒醅的混合樣品,第三輪次5個樣品分別記為DJ 3-1～DJ 3-5,歸group 1;第四輪次5個樣品分別記為DJ 4-1～DJ 4-5,歸group 2;第五輪次5個樣品分別記為DJ 5-1～DJ 5-5,歸group 3。池內發酵酒醅樣品從出窖后取樣,每個樣品為平行窖池上、中、下層酒醅的混合樣品,第三輪次5個樣品分別記為CJ 3-1～CJ 3-5,歸group 4;第四輪次5個樣品分別記為CJ 4-1～CJ 4-5,歸group 5;第五輪次5個樣品分別記為CJ 5-1～CJ 5-5,歸group 6。將每個混合樣品分成兩份,-80 ℃保存,進行代謝組學分析和微生物組成分析。

1.1.2 試劑

水、甲醇、氯仿、甲氧胺鹽酸鹽吡啶、正己烷,德國CNW Technologies GmbH公司;辛酸甲酯(C8∶0)、壬酸甲酯(C9∶0)、癸酸甲酯(C10∶0)、十二烷酸甲酯/月桂酸甲酯(C12∶0)、十四烷酸甲酯/肉豆蔻酸甲酯(C14∶0)、十六烷酸甲酯/棕櫚酸甲酯(C16∶0)、十八烷酸甲酯/硬脂酸甲酯(C18∶0)、二十烷酸甲酯/花生酸甲酯(C20∶0)、二十二烷酸甲酯/山俞酸甲酯(C22∶0)、二十四烷酸甲酯/木蠟酸甲酯(C24∶0)、二十六烷酸甲酯(C26∶0),瑞典Larodan生物公司;乙腈、L-2-氯苯丙氨酸,上海恒創生物;DNA抽提試劑盒、Qubit dsDNA檢測試劑盒,德國凱杰生物公司;Agcourt AMPure XP純化磁珠,美國Beckman生物公司。

1.2 儀器與設備

SB-5200DT超聲波清洗機,寧波新芝生物科技有限公司;LNG-T98冷凍濃縮離心干燥器,太倉市華美生化儀器廠;TYXH-I漩渦振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;TGL-16MS高速冷凍離心機,上海盧湘儀儀器有限公司;THZ-82A氣浴恒溫振蕩器,江蘇環宇科學儀器廠;DZF-6021真空干燥箱,上海慧泰有限公司;7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀、DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱,美國安捷倫公司;NovaSeq 6000測序儀器,美國Illumina公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 代謝風味物質分析

前處理:稱取60 mg樣本,放入1.5 mL的離心管中;加入2顆小鋼珠,加入600 μLV(甲醇)∶V(水)=1∶1(含2 μg/mLL-2-氯苯丙氨酸);在-40 ℃冰箱中預冷2 min后,放入研磨機中研磨(60 Hz,2 min);冰水浴超聲提取30 min;加入150 μL的氯仿,渦旋儀中渦旋2 min;冰水浴超聲提取30 min;-40 ℃靜置30 min;低溫離心10 min(13 000 r/min,4 ℃),取150 μL的上清液裝入玻璃衍生小瓶中;用離心濃縮干燥器揮干樣本;向玻璃衍生小瓶中加入80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL),渦旋振蕩2 min后,于37 ℃振蕩培養箱中60 min,進行肟化反應;將樣本取出后再加入50 μL的BSTFA衍生化試劑和20 μL的正己烷,加入10種內標(C8/C9/C10/C12/C14/C16/C18/C20/C22/C24,均為氯仿配制)10 μL,渦旋振蕩2 min后,于70 ℃反應60 min;取出樣本后,在室溫放置30 min,進行GC-MS代謝組學分析。

色譜條件:DB-5MS毛細管柱,載氣為高純氦氣(純度≥99.999%),流速1.0 mL/min,進樣口的溫度為260 ℃。進樣量1 μL,不分流進樣,溶劑延遲6.2 min。柱溫箱的初始溫度為60 ℃,保持0.5 min;以8 ℃/min程序升溫至125 ℃;8 ℃/min升溫至210 ℃;15 ℃/min升溫至270 ℃;20 ℃/min升溫至305 ℃,保持5 min。質譜條件:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質量掃描范圍:m/z50～500。

1.3.2 微生物組成分析

采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。使用V3、V4前端引物343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)和后端引物798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)擴增細菌的16S rRNA基因[7],使用真菌的前端引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和后端引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)擴增ITS區域[8]。PCR產物用Agcourt AMPure XP珠純化,用Qubit dsDNA檢測試劑盒定量,然后調整濃度進行測序。測序在Illumina NovaSeq 6000上進行,兩個成對末端讀取周期各250個堿基(Illumina公司,圣地亞哥,加州;OE生物科技公司;中國上海)。

原始數據為FASTQ格式。首先使用cutadapt軟件,對raw data序列,剪切掉引物序列,然后使用DADA2,將上一步合格的雙端raw data按照QIIME 2(2020.11)默認參數進行質量過濾,降噪,拼接及去嵌合體等質控分析[9-10],得到代表序列及擴增子序列變異(amplicon sequence variants,ASV)豐度表格。使用QIIME 2軟件包挑選出各個ASV的代表序列后,并將所有代表序列與數據庫進行比對注釋,16S使用Silva(version138)數據庫比對,ITS使用Unite數據庫比對。物種比對注釋使用q2-feature-classifier軟件默認參數進行分析。

1.4 數據分析

根據屬水平分類操作單元(operational taxonomic units,OTUs)的相對豐度計算微生物群落組成,采用pheatmap軟件包進行相關性分析,并采用相關熱圖進行可視化,在屬水平上顯示代謝風味物質與微生物之間的關系。繪圖利用R包實現。

2 結果與分析

2.1 微生物的群落結構組成

在屬水平下,根據豐度排序Top15細菌屬繪圖如圖1所示,堆積發酵的細菌屬中,乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、克羅彭施泰特氏菌屬(Kroppenstedtia)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)、羅爾斯通菌屬(Ralstonia)、意大利小海員菌屬(Nautella)和芽孢桿菌屬(Bacillus)的相對豐度較高,與第四、五輪次相比,第三輪次堆積發酵酒醅中細菌區系差異更大,整體上不及第四、五輪次豐富,這與用曲量、酒醅酸度和環境溫度有關,第三、四、五輪次投曲量是依次減少的,第三輪次酸度要低于第四、五輪次,第三輪次堆積發酵時環境溫度也更低。第四、五輪次堆積酒醅細菌群系更豐富說明第四、五輪次堆積發酵更全面,細菌代謝物更豐富,為四、五輪次基酒風味更飽滿、酒質更優創造了很好的前提條件。Lactobacillus在第四輪次堆積酒醅樣品中相對豐度高達58%,有研究表明,Lactobacillus在貴州核心產區的堆積酒醅中和車間釀造環境中均比較豐富,作為有益菌群參與醬香酒的堆積發酵過程[10-11]。Kroppenstedtia在第四輪次堆積酒醅樣品中占比最高,達39%,Kroppenstedtia屬于嗜熱菌屬,在其他菌屬無法正常生長的高溫環境下,它依然可以保持較高的活性[12]。Virgibacillus在第三輪次堆積發酵酒醅中的相對豐度明顯低于第四、五輪次,這與酒醅的酸度密切相關,Virgibacillus可利用麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖產酸,可為發酵產生物淀粉酶、蛋白酶。Bacillus能降解淀粉、蛋白質等大分子物質產生一些生物活性物質,它們是醬香酒風味物質的前體[13]。窖池發酵的細菌屬中,Lactobacillus占比最大,是窖池發酵的絕對優勢功能細菌屬,Lactobacillus的生長代謝與發酵酒醅的溫度密切相關,它的代謝消長可以直接影響整個細菌群落結構的演替[14]。極端嚴格好氧菌醋酸桿菌屬(Acetobacter)能產生細菌纖維素,氧化葡萄糖和乙醇,轉化成影響醬香酒風味的酯類物質[15],它在第三輪次～第五輪次發酵細菌屬中的占比依次降低,在第五輪次堆積發酵酒醅樣品中基本未檢出,在出窖酒醅中相對豐度極低。WANG等[16]對北方醬香酒第五、六輪次酒醅發酵優勢細菌研究發現,3個優勢細菌屬分別為Lactobacillus、大洋芽孢桿菌(Oceanobacillus)、Virgibacillus,與湖南地區優勢細菌屬基本相同,但由于氣候環境的差異,各地優勢菌群豐度有所不同。

圖1 不同輪次發酵酒醅優勢細菌屬群落結構組成Fig.1 Dominant bacterial community structure of fermented grains collected from different fermentation cycle of soy sauce aroma style Baijiu

在屬水平下,根據豐度排序Top15的真菌屬組成如圖2所示,在堆積發酵的真菌屬中,紅曲霉屬(Monascus)、畢赤酵母屬(Pichia)、絲依霉屬(Byssochlamys)、釀酒酵母屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、擬青霉屬(Paecilomyces)、近地傘屬(Parasola)和嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)的相對豐度較高,其中Monascus的相對豐度最高達96%,在第四輪次堆積酒醅真菌屬中占據絕對優勢。Monascus具有較高的產淀粉酶和蛋白酶的能力,對于醬香酒風味物質的形成具有重要貢獻[17],沈毅等[18]從四川郎酒的大曲、酒醅和窖泥中對比分析得知四川產區醬酒醅中Monascus的相對豐度也很高。Byssochlamys在第三輪次和第五輪次堆積酒醅中占比高,Byssochlamys能產生耐熱的子囊孢子,在85 ℃以上的環境中都能存活,并且在低氧條件下也能保持較高的活力,它能產生果膠分解酶,有利于酒醅糖化[19]。窖池發酵的真菌屬中,第三輪次Thermoascus占比最高,第四輪次Monascus占比最高,第五輪次Parasola占比最高。Thermoascus是一種耐熱性較強的菌屬,能長時間在45 ℃以上的高溫環境中正常生長代謝,代謝產生耐熱的纖維素酶和木聚糖酶[20]。有研究表明,Thermoascus為貴州核心產區醬香型大曲中的絕對優勢真菌屬[21],說明發酵酒醅中Thermoascus來源于高溫大曲,其豐度表現與用曲量密切相關。從堆積發酵和窖池發酵一個完整的發酵輪次來看,第三、四、五輪次優勢真菌屬Saccharomyces的相對豐度表現很穩定,且每一輪次池內發酵Saccharomyces的豐度要高于同輪次堆積發酵。釀酒酵母是醬香型白酒釀造中最常見的產乙醇的真菌微生物,在發酵過程中它不僅可以產生大量的乙醇,還可以將原輔料中的氨基酸等物質轉化成各種風味成分[22],對醬香酒的風味形成具有非常重要的作用。

圖2 不同輪次發酵酒醅優勢真菌屬群落結構組成Fig.2 Dominant fungal community structure of fermented grains collected from different fermentation cycle of soy sauce aroma style Baijiu

2.2 差異代謝產物的篩選與鑒定

對30個發酵酒醅樣品進行代謝組學鑒定,共鑒定出269個代謝物,按照發酵輪次進行分組共篩選出74個 差異代謝物,見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035367)。包括有機氧化合物24個,羧酸及衍生物8個,脂肪酰基類化合物7個,核苷酸類4個,甘油酯類2個,內酯類2個,有機氮化合物 2個,呋喃類1個,黃酮類1個,其他類23個。將主要差異代謝產物映射到KEGG數據庫檢索出7條顯著的代謝通路[23],均與釀酒酵母相關,選擇顯著性富集pathway進行氣泡圖繪制,如圖3所示。7條顯著性代謝通路分別為ABC轉運蛋白代謝、β-丙氨酸代謝、磷酸戊糖途徑代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化和丙酮酸代謝。

圖3 代謝通路富集氣泡圖Fig.3 Enrichment bubble plot of metabolic pathway

附表1顯示,所有差異代謝物中葡萄糖的相對表達量最高,第三輪次堆積發酵為4.250±0.465,窖池發酵為2.475±0.135,第四輪次堆積發酵為2.541±0.074,窖池發酵為1.073±0.201,第五輪次堆積發酵為2.520±0.441,窖池發酵為0.358±0.031,整體上表達量第三輪次高于第四、五輪次,葡萄糖與發酵前期霉菌及其所產酶對淀粉的糖化密切相關,它為活細胞提供營養,是糖酵解糖異生和蛋白質代謝的重要基礎,是醬香酒發酵中最主要的糖,在發酵過程中被酵母充分利用產生酒精。L-谷氨酰胺是β-丙氨酸代謝的前體,在第三輪次堆積發酵酒醅樣品中的相對表達量為1.744±0.049,第四輪次堆積發酵為0.390±0.751,第五輪次堆積發酵為0.018±0.001,呈明顯依次下降的趨勢,窖池發酵同樣是第三輪次的相對表達量最高,表明在第三輪次發酵過程中葡萄糖和谷氨酰胺的代謝較為旺盛。D-甘露糖在第三輪次堆積發酵酒醅中的相對表達量為1.954±0.476,高于第四、五輪次,在第三輪次窖池發酵酒醅中的相對表達量為0.534±0.110,同樣高于第四、五輪次。D-甘露糖是一種低熱量的單糖,甜度分別是蔗糖和葡萄糖的60%和86%[24],它是釀酒酵母細胞壁的主要組成成分。D-甘露糖是合成甘露糖醇的前體,通過果糖和甘露糖代謝途徑轉化成D-甘露糖醇,D-甘露糖醇呈甜味,水溶液中甜味閾值達40.0 mmol/L,具有涼爽感[25],D-甘露糖醇可能是讓第三輪次酒具有醇甜且尾爽凈特點的重要風味物質之一。D-木酮糖是阿拉伯糖醇的前體物質,參與磷酸戊糖途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化,阿拉伯糖醇呈甜味,水溶液中甜味閾值達43.1 mmol/L[25]。D-木酮糖在第三輪次窖池發酵酒醅中的相對表達量為0.330±0.015,高于第四輪次和第五輪次,堆積發酵酒醅相對表達量同樣也是第三輪次最高,D-木酮糖可能是讓第三輪次酒具有醇甜口感的重要前體物質。海藻糖是酵母進行ABC轉運蛋白代謝、淀粉與蔗糖代謝的產物,海藻糖穩定性強,能維持生物大分子的結構和功能,是評價酵母乙醇耐受性的重要指標[26]。海藻糖呈甜味,在第三輪次堆積發酵酒醅中的相對表達量為0.894±0.125,高于第四輪次和第五輪次,海藻糖可能是讓第三輪次酒具有醇甜口感的重要前體物質。異麥芽糖在第三輪次堆積發酵酒醅中的相對表達量為1.563±0.144,窖池發酵酒醅中的相對表達量為0.558±0.056,整體上第四輪次和第五輪次與之相比要低很多,表明第三輪次發酵過程中淀粉酶分解淀粉以及葡萄糖焦糖化反應旺盛。亞麻酸呈焦苦味,帶澀,水溶液中苦味閾值為0.6～1.2 mmol/L[25],參與釀酒酵母α-亞麻酸代謝過程。亞麻酸在第五輪次堆積發酵酒醅中的相對表達量為0.206±0.008,窖池發酵酒醅中的相對表達量為0.171±0.004,明顯高于第三輪次和第四輪次,亞麻酸可能是造成第五輪次酒具有焦苦口感的重要風味物質。

2.3 優勢細菌屬與主要差異代謝物的關聯分析

微生物的代謝產物種類含量的不同是造成第三、四、五輪次酒具有細微口感差別的關鍵原因,優勢細菌與差異代謝物的關聯更是體現其功能所在。基于相關性分析計算細菌和代謝物數據間的關聯性,選取P<0.05的關系對繪制成網絡圖[27-28],見圖4。黃色線代表正相關,藍色線代表負相關,線的粗細代表相關性系數的高低。

圖4 優勢細菌屬與差異代謝物相關性網絡圖Fig.4 Network diagram of correlation between dominant bacterial genera and differential metabolites

差異代謝物與優勢細菌的相關性分析表明,Kroppenstedtia與海藻糖和油酸酰胺呈正相關,與D-木酮糖和己糖呈負相關;Virgibacillus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關,與D-木酮糖和己糖呈負相關;Oceanobacillus與松三糖、乳糖醇、海藻糖和油酸酰胺呈正相關,與D-木酮糖和己糖呈負相關;Bacillus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關,與D-木酮糖和己糖呈負相關;Staphylococcus與海藻糖和油酸酰胺呈正相關,己糖呈負相關。Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus、Bacillus和Staphylococcus均與海藻糖和油酸酰胺呈正相關,表明這5個細菌屬對釀酒酵母進行ABC轉運蛋白代謝和淀粉與蔗糖代謝起到了很好的協同作用,對脂肪酸的生物合成起到了很好的促進作用。Kroppenstedtia、Virgibacillus、Oceanobacillus、Bacillus和Staphylococcus均與D-木酮糖呈負相關,表明這5個細菌屬共同參與了磷酸戊糖途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉化,參與了阿拉伯糖醇的調控,對縮小不同輪次醬香型白酒醇甜口感差異具有重要作用。

3 結論與討論

基于微生物多樣性檢測探究了不同輪次發酵酒醅中細菌和真菌的群落結構特征,基于GC-MS非靶向代謝組學分析了醬香酒不同輪次發酵酒醅代謝產物的差異,與微生物的聯合分析表明,8個優勢細菌屬中有5個優勢細菌屬對釀酒酵母的關鍵代謝具有協同作用,這為人工改善醬香酒發酵微生態提供了理論支撐。另外,海藻糖、D-木酮糖、D-甘露糖等對第三輪次酒醇甜口感的影響、亞麻酸對第五輪次酒焦苦口感的影響還需進一步驗證,這是研究醬香型白酒黃金輪次酒口感細微差異亟需解決的問題,對定向調控發酵酒醅特征代謝物的合成進程,提升醬香型白酒品質具有重要意義。