RNF187在前列腺癌細胞中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、侵襲的影響

王欣文?陳波?李國兵?肖世偉?王強

【摘要】目的 探討環指蛋白187（RNF187）在前列腺癌細胞中的表達及其對前列腺癌細胞增殖、侵襲的影響。方法 通過癌癥基因組圖譜（TCGA）和高通量基因表達（GEO）數據庫分析前列腺癌組織和正常組織間RNF187的表達差異，體外培養正常前列腺上皮細胞系RWPE-1和人前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2、DU145、PC-3，用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定RWPE-1、LNCaP、C4-2、DU145、PC-3中RNF187 mRNA表達水平，蛋白免疫印跡法測定RNF187蛋白表達水平。轉染RNF187-siRNA1、RNF187-siRNA2至DU145、PC-3，RT-qPCR 測定RNF187 mRNA相對表達量、CCK-8法測定細胞活性，5-乙炔基-2?脫氧尿嘧啶核苷（EdU）法測定細胞增殖能力，Transwell小室測定細胞的遷移和侵襲能力，蛋白免疫印跡法檢測RNF187和上皮-間充質轉化（EMT）標志蛋白及基質金屬蛋白酶（MMP-9）的蛋白表達水平。結果 TCGA和GEO數據集中，前列腺癌組織中RNF187表達量均高于正常前列腺組織，Gleason評分及分期較高者的表達量較高（P均<0.05）。人前列腺癌細胞PC-3、LNCaP、C4-2、DU145中RNF187 mRNA及蛋白表達均高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1（P均< 0.01）。RNF187-si1組、RNF187-si2組DU145、PC-3中的RNF187 mRNA相對表達量分別低于Control組的DU145和PC-3中的RNF187 mRNA相對表達量（P均< 0.001）。RNF187敲減后，DU145、PC-3細胞增殖活性及增殖、侵襲和遷移能力下降，RNF187、神經鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、MMP-9蛋白相對表達量均降低，上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）相對表達量升高（P均< 0.05）。結論 RNF187在前列腺癌組織中過表達，敲減RNF187可降低前列腺癌DU145、PC-3的細胞增殖活性及增殖、侵襲和遷移能力。

【關鍵詞】前列腺癌；環指蛋白187；上皮間質轉化；侵襲轉移；泛素化

Expression level of RNF187 and its effect on the proliferation and invasion of prostate cancer cells Wang Xinwen△， Chen Bo， Li Guobing， Xiao Shiwei， Wang Qiang. △Guizhou Medical University， Guiyang 550004， China

Corresponding author， Wang Qiang， E-mail： xyfsywq@163.com

【Abstract】Objective To investigate the expression level of RING finger protein 187 （RNF187） and its effect on the proliferation and invasion of prostate cancer （PCa） cells. Methods The differences in the expression of RNF187 between PCa and normal tissues was mined through TCGA and GEO databases. Normal prostate epithelial cell line RWPE-1， and human PCa cell lines LNCaP， C4-2， DU145 and PC-3 cell lines were cultured in vitro. The expression levels of RNF187 mRNA in RWPE-1， LNCaP， C4-2， DU145 and PC-3 were determined by quantitative fluorescent real-time PCR （RT-qPCR）. The expression level of RNF187 protein was determined by Western blot. DU145， PC-3 cells were transfected with RNF187-siRNA1 and RNF187-siRNA2. The relative expression level of RNF187 mRNA was determined by RT-qPCR. Cell viability was detected by CCK-8 assay. Cell proliferation was measured by 5-ethynyl-2?-deoxyuridine （EdU） labeling. Cell migration and invasion were measured by Transwell chamber. The expression levels of RNF187， epithelial-mesenchymal transition （EMT） marker proteins and matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） were determined by Western blot. Results In TCGA and GEO datasets， the expression level of RNF187 in the PCa tissues was significantly up-regulated than that in the normal prostate tissues. Patients with higher Gleason scores and higher staging had higher expression levels of RNF187 （all P < 0.05）. The expression levels of RNF187 mRNA and protein in PC-3， LNCaP， C4-2 and DU145 cells were significantly up-regulated than those in RWPE-1 cells （all P < 0.01）. The relative expression levels of RNF187 mRNA in DU145 and PC-3 cells in the RNF187-si1 and RNF187-si2 groups were significantly down-regulated than those in the control group （all P < 0.001）. After RNF187 knock-down， the viability， proliferation， invasion and migration capabilities of DU145 and PC-3 cells were significantly decreased， the relative expression levels of RNF187， N-cadherin， Vimentin and MMP-9 proteins were significantly down-regulated， whereas the relative expression levels of E-cadherin were significantly up-regulated （all P <

0.05）. Conclusion RNF187 is over-expressed in PCa tissues. Knock-down of RNF187 can reduce the cell viability， proliferation， invasion and migration of DU145 and PC-3 cells.

【Key words】Prostate cancer； RING finger protein 187； Epithelial-mesenchymal transition； Invasion and metastasis；

Ubiquitination

前列腺癌是一種從低侵襲性到彌散性進展的泌尿系統腫瘤，在2020年的230萬新增癌癥病例中占7.3%，僅次于乳腺癌、肺癌和結直腸癌［1-2］。近年我國的前列腺癌發病率逐漸增加［3］。早期前列腺癌通常無明顯癥狀，當出現血尿、骨痛等相關癥狀就診時，多數已發展為中晚期疾病，癌細胞已發生遠處轉移，失去了根治性手術的機會，這是前列腺癌患者死亡的主要原因［4-5］。因此，針對前列腺癌侵襲轉移的機制探討如何延長前列腺患者的生存期、提高患者生活質量具有重要意義。環指蛋白187（RNF187）屬于含有環結構域的E3連接酶家族，具有E3泛素連接酶活性，可促進底物泛素化。RNF187在乳腺癌、直腸癌、肝癌及腦膠質瘤中過表達，促進結直腸癌細胞的增殖、轉移，與乳腺癌的易復發、轉移等不良預后有關［6-7］。然而，RNF187在前列腺癌中的表達及其臨床意義尚不清楚，為此本研究擬探討其在前列腺癌中的差異表達和對前列腺癌的侵襲、轉移及其與患者預后的關系。

材料與方法

一、材 料

正常前列腺上皮細胞系RWPE-1和人前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2、DU145、PC-3購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。干擾小RNA（siRNA）-對照 （si-NC）、RNF187-siRNA1 （RNF187-si1）、RNF187-siRNA2 （RNF187-si2）購自廣州銳博生物技術有限公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自美國Gibco公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購武漢博士德生物工程有限公司，彩色預染蛋白分子量標準（10～170 kDa）購自美國塞默飛世爾公司，增強化學發光（ECL）試劑盒購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，Transwell小室購自美國康寧公司，細胞計數試劑盒（CCK-8）購自江蘇江萊生物技術有限公司。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。RNF187抗兔抗體購自美國Invitrogen公司，神經鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）抗體、β-actin抗兔抗體、抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司。

二、方 法

1. 生物信息學分析

本研究納入癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫中492例前列腺癌患者和152例配對癌旁正常組織，通過Students t檢驗分析RNF187轉錄組水平的表達差異。通過R軟件分析和預測RNF187相關的蛋白-蛋白互作網絡（PPI）、細胞外RNA調控網絡及轉錄因子調控網絡。從高通量基因表達（GEO）數據庫中篩選出前列腺癌患者的RNA-Seq信息進行數據分析，使用R語言的edge包篩選出差異表達的RNA-Seq，并進一步篩選與患者生存相關的RNA-Seq信息，并分析其與前列腺癌預后的相關性。

2. RNF187 mRNA在前列腺癌不同細胞系中表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR），按照TRIzol試劑盒說明書操作步驟提取樣本中總RNA，使用NanoDrop2000測定RNA的濃度，在反應體系10 μL、37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃ 50 min的反轉錄條件下，以提取的RNA為模板反轉錄生成cDNA，進行多次循環，在最后一次循環結束后于69 ℃延伸15 min。以GAPDH為內參，引物序列為：RNF187上游5'-TGGAAATCATGAGAACTTR-3′，下游5'-ACGGTCCATCACGTGTCC-3′；GAPDH上

游5'-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3′，下游5′-

GTGGTCGTGAGGGCAATG-3′。用2-??Ct法分析目的基因的相對表達量。

3. RWPE-1、LNCaP、C4-2、PC-3、DU145細胞培養及細胞轉染

RWPE-1細胞株用K-SFM培養基，PC-3、DU145細胞株用DMEM培養基，LNCaP、C4-2用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，于5%CO2、37℃、飽和濕度條件下培養，根據細胞狀態定期更換培養基。將密度為40%的PC-3、DU145細胞傳代到6孔板中，依據Lipofectamine 2000轉染試劑盒操作說明制作轉染物并轉染DU145、PC-3細胞，將2種細胞分為si-NC組（細胞轉染si-NC）、RNF187-si1組（細胞轉染RNF187-si1）、RNF187-si2組（細胞轉染RNF187-si2）。序列具體為：RNF187-si1 5′-TCTCGGAGCTGGAGAAGAA-3′，RNF187-si2 5′-GCACTGACCGACTACAAGA-3′。轉染后各組細胞于培養箱繼續培養，使用RT-qPCR驗證轉染效率。

4. 轉染后細胞增殖活性檢測

采用CCK-8法，按試劑盒說明書操作，用酶標儀測定在450 nm波長處的吸光度（即A值）并記錄結果。

5. RNF187敲減對細胞增殖能力影響的驗證

采用EdU法，按試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡拍照、用軟件Image J處理，計算增殖率。細胞增殖率（%）=EdU陽性染色細胞（紅色）/總細胞（藍色）的百分比×100%。

6. RNF187敲減對細胞侵襲與遷移能力影響的檢測

采用Transwell實驗，按試劑盒說明書操作，晾干后置于200倍顯微鏡下，隨機選擇5個視野觀察、計數、拍照。

7. RNF187敲減對EMT標志蛋白和MMP-9表達的影響

采用蛋白免疫印跡法，按試劑盒說明書操作，ECL顯影，采集圖片用Image J量化分析灰度值。

三、統計學處理

采用SPSS 22. 0進行數據分析，符合正態分布的變量以表示，2組間比較行t檢驗，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

結果

一、TCGA和GEO數據庫中RNF187轉錄水平的差異表達分析結果

TCGA-PRAD數據集中，前列腺癌腫瘤組織中RNF187表達量高于正常組織（P < 0.001），見圖1A。4個前列腺癌GEO數據集（GSE6919、GSE32571、

GSE6608、GSE70770）中，RNF187在前列腺癌組織中表達量均高于正常前列腺組織（P均 < 0.05），見圖1B～E。TCGA-PRAD臨床數據分析顯示，Gleason評分> 6分前列腺癌組織的RNF187表達量高于

Gleason評分 ≤6分前列腺癌組織（P < 0.001）；T3～4

期前列腺癌組織的RNF187表達量高于T1～2期前列腺癌組織（P < 0.05）。

二、RNF187在正常前列腺上皮細胞及前列腺癌細胞中的表達

RT-qPCR顯示，人前列腺癌細胞PC-3、LNCaP、C4-2、DU145中RNF187相對表達量均高于正常前列腺上皮細胞RWPE-1（P均 < 0.01），見圖2A。進一步提取相應細胞蛋白進行蛋白免疫印跡實驗，結果與RT-qPCR一致，見圖2B。

三、RNF187敲減對前列腺癌細胞DU145和PC-3增殖能力的影響

RT-qPCR顯示，RNF187-si1組、RNF187-si2組DU145、PC-3中的RNF187 mRNA相對表達量分別低于Control組的DU145和PC-3中的RNF187 mRNA相對表達量（P均 < 0.001），提示轉染有效，見圖3A。CCK-8法檢測結果顯示，RNF187-si1、RNF187-si2組的PC-3和DU145與Control組比較，在96 h時細胞增殖活性均明顯下降（P均 < 0.05），見圖3B、C。EdU細胞增殖檢測結果顯示，與Control組相比，RNF187-si1組、RNF187-si2組DU145、PC-3的細胞增殖能力明顯下降，見圖3D。DU145和PC-3中RNF187-si1組和RNF187-si2組的EdU陽性率均低于Control組（P均 < 0.001），見表1。

四、RNF187敲減對前列腺癌細胞PC-3和DU145侵襲與遷移能力的影響

RNF187敲減后，前列腺癌細胞DU145和PC-3的侵襲與遷移能力均下降（P均 < 0.001），見表2、圖4。

五、RNF187敲減對前列腺癌細胞DU145、PC-3中RNF187和EMT標志蛋白表達的影響

RNF187敲減后，DU145、PC-3中RNF187、N-cadherin、Vimentin、MMP-9蛋白相對表達量均降低，E-Cadherin蛋白相對表達量升高（P均 < 0.05），見表3、圖5。

討論

前列腺癌起病隱匿，早期沒有明顯癥狀，我國大多數前列腺癌患者在發現時已是中晚期。近年來，隨著老齡化人口的增加以及新的診斷標志物如尿液外泌體circ_0040507的發現，我國前列腺癌的檢出率迅速上升，前列腺癌的發病率已經趨近于膀胱癌，且早期前列腺癌占比有所增加［8-10］。早期前列腺癌并不致命，遠處轉移的并發癥是中晚期前列腺癌患者的主要死亡原因，所以了解前列腺癌的轉移和侵襲的潛在機制，有利于控制疾病的進展，降低病死率。RNF187也稱為AP-1共激活因子（轉錄激活因子1），是一種包含環指域的泛素E3連接酶。RNF187是生長因子信號c-Jun共激活劑，對于AP-1在細胞增殖中的功能至關重要，參與了多種底物泛素化的過程［11］。RNF187在癌癥中主要扮演致癌因子的角色，然而在食道鱗狀細胞癌和三陰性乳腺癌中卻表現出腫瘤抑制活性［12-13］。RNF187在乳腺癌、直腸癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌及腦膠質瘤中過表達，促進結直腸癌細胞的增殖和轉移［14］。趙恒奎等［15］研究發現，RNF187在腦神經膠質瘤組織中過表達，且其表達水平與腦膠質瘤的惡性程度呈正相關，RNF187參與腦膠質瘤細胞的增殖和侵襲過程，RNF187對評估腦膠質瘤患者的生存預后有一定價值。Li等［16］研究發現，RNF187在乳腺癌中呈高表達且促進了乳腺癌和移植小鼠模型中癌細胞的增殖和凋亡。p53可被RNF187誘導而降解，這一過程增加了乳腺癌細胞的侵襲和增殖能力，RNF187內源性地抑制了p53介導的抑癌信號通路［17］。EMT標志蛋白和MMP-9的表達與免疫微環境中的T淋巴細胞、腫瘤相關巨噬細胞等標志物呈正相關，改變腫瘤微環境的免疫細胞豐度可促進多種腫瘤的侵襲和轉移［18-19］。

本研究中，生物信息學分析結果顯示RNF187在前列腺癌組織中過表達，前列腺癌細胞系DU145、PC-3、LNCaP、C4-2中及人正常前列腺上皮細胞RWPE-1中RNF187的表達存在差異。進一步通過前列腺癌細胞DU145、PC-3研究RNF187在前列腺癌細胞中的發生及侵襲機制，CCK-8、EdU、Transwell和蛋白免疫印跡實驗顯示，RNF187敲減后，前列腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力受到抑制，表明RNF187促進了前列腺癌的增殖、侵襲和遷移，與生物信息學分析及其他相關腫瘤研究結論一致。RNF187在未來可能成為前列腺癌治療一個新的靶點。本研究的不足在于僅進行了基本的功能學研究，對于RNF187在前列腺癌中詳細的分子機制的生物學過程還需要構建過表達細胞株和體內實驗進一步驗證。

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（收稿日期：2023-03-08）

（本文編輯：林燕薇）