九份特早熟和早熟荔枝種質(zhì)資源有機酸組分及含量特征分析

董 晨，鄭雪文，馬智玲，王 弋，全振炫，李偉才*，胡桂兵

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江 524091；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州 510642）

荔枝（Litchi ChinensisSonn.）為無患子科（Sapindaceae）荔枝屬（LitchiSonn.）常綠果樹。我國是世界上栽培荔枝最早和最多的國家，已有2 200 多年的栽培歷史，種質(zhì)資源豐富（擁有種質(zhì)600 多個，占全世界的60%）。有機酸組分是決定水果果實品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)的主要成分，有機酸組分及含量的差異使得果實各具獨特的風(fēng)味。根據(jù)有機酸含量最高的組分可將水果劃分為蘋果酸優(yōu)勢型、檸檬酸優(yōu)勢型和酒石酸優(yōu)勢型[1]。

根據(jù)已有的文獻(xiàn)報道，荔枝屬于蘋果酸優(yōu)勢型，但荔枝果肉中的有機酸組分尚未有定論[2]。Paull 等報道成熟荔枝果肉主要有機酸為琥珀酸和蘋果酸[3]；孟祥春等利用HPLC 法測定5 個荔枝品種的有機酸發(fā)現(xiàn)，蘋果酸是荔枝果肉中的主要有機酸，其次是檸檬酸和琥珀酸，普通品種的蘋果酸含量最高，優(yōu)質(zhì)品種的檸檬酸含量高于普通品種[4]；喬方等采用HPLC測定了不同產(chǎn)區(qū)妃子笑、懷枝、糯米糍及深圳南山妃子笑、糯米糍和桂味荔枝的有機酸含量發(fā)現(xiàn)，荔枝中主要含有草酸、酒石酸、乳酸和蘋果酸等8 種有機酸，其中酒石酸和蘋果酸含量較高，草酸、莽草酸、富馬酸的含量較低，同一品種在不同產(chǎn)區(qū)有機酸含量及組分存在差異，優(yōu)質(zhì)品種的總有機酸含量較普通品種的低[5-7]；蔡燦軍等應(yīng)用UPLC 分析烏葉和蘭竹荔枝果肉有機酸組分，發(fā)現(xiàn)荔枝果肉有機酸組分均以積累蘋果酸為主，其次是富馬酸，二者含量占有機酸總量的90%[8]。黃桂穎等用RP-HPLC 測定增城桂味果肉中的10 種有機酸發(fā)現(xiàn)，蘋果酸是主要的有機酸，其次是乳酸、酒石酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、草酸、莽草酸、富馬酸、丙酮酸[9]；胡志群等利用HPLC發(fā)現(xiàn)荔枝果肉中主要有機酸是蘋果酸和酒石酸，此外還有少量的抗壞血酸和草酸[10]；王思威等通過HPLC-MS/MS 技術(shù)對5 個荔枝品種的10種有機酸進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，蘋果酸是主要的有機酸，其次是乳酸、檸檬酸、富馬酸[11]；黃沛蒼等利用HPLC 測定荔枝中的有機酸含量時發(fā)現(xiàn)，果肉中含有蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等[12]；溫青玉對桂味、妃子笑、懷枝3 個荔枝品種果實成熟過程中的有機酸進(jìn)行含量分析表明，荔枝果肉中的有機酸主要組分是蘋果酸、酒石酸，其次是琥珀酸和乙酸[13]。目前已有關(guān)于荔枝果肉有機酸組分和含量的分析研究報道多以探討方法和定性為主，研究的荔枝品種中缺乏對特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源果肉的有機酸組成和含量特征系統(tǒng)分析。因此，本研究擬通過對九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源果肉中的草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸等11 種有機酸組分的含量特征進(jìn)行分析，揭示特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源的有機酸組分及含量存在的差異，為荔枝優(yōu)良新品種的選育及新品種篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

試驗于2021年在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所荔枝種質(zhì)圃進(jìn)行，選取九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源為研究試材，分別編號為3YH、4YH、9918、9919、D11、D13、HML、NXZS 和BTY。樣本樹為正常生長結(jié)果的成齡樹，栽培條件相同，管理水平一致。每份種質(zhì)均在果實成熟期選取3 株樣本樹，從樹冠外圍不同方向取30個大小均勻、無病蟲害的果實，采摘后當(dāng)即取果肉混勻后分3 份液氮速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.2 儀器方法

利用LC-20A 液相色譜儀（配紫外檢測器）分析荔枝果實中的有機酸成分，結(jié)果以色譜圖、保留時間、峰面積與濃度的比例關(guān)系呈現(xiàn)，外標(biāo)法定量。

1.2.1 樣品前處理

1）稱取1.0 g 果肉加入5 mL 0.2%偏磷酸研磨提取，4 ℃10 000 r·min-1離 心15 min，上清液轉(zhuǎn)入10 mL具塞刻度試管，殘渣加入4 mL 0.2%偏磷酸繼續(xù)在4 ℃10 000 r·min-1離心，上清液合并至刻度試管，并定容至10 mL，4 ℃冰箱保存待測。

2）上機前過0.22 μm的水系濾膜裝小瓶。

1.2.2 標(biāo)樣制作

1）配置5 mg·mL-1的各個有機酸（草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸）的單標(biāo)溶液，即每個有機酸稱取50 mg，用0.2% 偏磷酸溶解并定容至10 mL容量瓶，作為各個有機酸組分的單標(biāo)溶液。

2）配置各個組分的不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mg·mL-1，4 ℃冰箱中保存，待測。可以先配置1 mg·mL-1濃度的混標(biāo)溶液，然后再分別稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，獲得相應(yīng)濃度。

1.2.3 儀器方法

柱 子：shim-pack GIST C18-AQ(5 μm×4.6 mm×250 mm) ；柱子溫度：40 ℃；流速：1 mL·min-1；流動 相：B 泵100% 50 mmol NaH2PO4水溶液（pH 值=2.15，使用H3PO4調(diào)配，使用前先過0.22 μm 的水系膜，再超聲去氣泡，冷卻后上機使用）；波長：UV，210 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。試驗結(jié)果以鮮質(zhì)量計。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2003 和SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機酸組分含量

11 種有機酸出峰順序為：草酸、酒石酸、甲酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸（見圖1）。九份特早熟和早熟荔枝種質(zhì)資源成熟期果肉有機酸組分及含量、變異情況見表l、表2。除了BTY 檢測到11 種有機酸組分外，其余的8 份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源均沒有檢測到甲酸。11 種有機酸組分中蘋果酸含量最高，其次是乳酸、酒石酸、抗壞血酸、富馬酸、乙酸、檸檬酸，馬來酸、草酸、琥珀酸這3種有機酸含量較低。

表2 特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實有機酸組分的變異情況

圖1 十一個有機酸標(biāo)準(zhǔn)樣品液相色譜圖

表1 特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實有機酸組分及含量 單位：mg·g-1(FW)

蘋果酸在九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果肉中含量最高，變化范圍為1.89～22.52 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為59%。九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源中蘋果酸含量由高到低依次為D13＞4YH＞HML＞3YH＞D11＞9918＞9919＞NXZS＞BTY，D13 與其他8 份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)蘋果酸含量差異顯著，9918、9919、3YH、D11、HML、NXZS的蘋果酸含量沒有顯著差異。

乳酸含量變化范圍為0.83～5.09 mg·g-1(FW)，平均值為2.57 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為48%。九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源中乳酸含量由高到低依次為9919＞9918＞HML＞4YH＞NXZS＞D13＞D11＞BTY＞3YH，其中9919 與3YH、D11、D13、BTY 乳酸含量有顯著差異，9918、HML、4YH、NXZS、D13、D11、BTY、3YH間沒有顯著差異。

酒石酸含量變化范圍為1.27～3.17 mg·g-1(FW)，平均值為1.96 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為41%。九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源中酒石酸含量由高到低依次為D11＞D13＞HML＞9919＞9918＞4YH＞3YH＞BTY＞NXZS，D11、D13、HML 間酒石酸含量沒有顯著差異，3YH、4YH、9918、9919、NXZS、BTY 間酒石酸含量沒有顯著差異。D11、D13、HML 與3YH、4YH、9918、9919、NXZS、BTY酒石酸含量差異顯著。

抗壞血酸含量變化范圍為0.16～3.32 mg·g-1(FW)，平均值為1.84 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為55%。抗壞血酸含量由高到低依次為D13＞4YH＞NXZS＞9919＞HML＞3YH＞D11＞9918＞BTY，4YH、D13、NXZS間抗壞血酸含量沒有顯著差異，3YH、9918、9919、D11、HML、NXZS 間抗壞血酸含量沒有顯著差異，BTY 與其他特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源抗壞血酸含量有顯著差異。

富馬酸的含量為0.11～2.64 mg·g-1(FW)，平均值為0.79 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為104%。BTY 中富馬酸含量最高，與其他的特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源富馬酸含量有顯著差異。D11 和SYH 間富馬酸含量沒有顯著差異，9918、9919、D13、HML、NXZS 間富馬酸含量沒有顯著差異；4YH 富馬酸含量最低，與其他的特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源富馬酸含量有顯著差異。

乙酸的含量為0.04～3.28 mg·g-1(FW)，平均值為0.71 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為142%。乙酸含量最高的種質(zhì)為BTY，與其他特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源乙酸含量有顯著差異。9919 和D11 間乙酸含量沒有顯著差異；3YH、4YH、NXZS、9918、HML、D13 間乙酸含量沒有顯著差異。

檸檬酸的含量為0.20～0.84 mg·g-1(FW)，平均值為0.50 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為37%。D13 檸檬酸含量最高，BTY 檸檬酸含量最低。3YH、4YH、9918、9919間檸檬酸含量沒有顯著差異，D11、HML、NXZS間檸檬酸含量沒有顯著差異。

琥珀酸、草酸、馬來酸在有機酸組分中含量較低。琥珀酸含量為0.12～0.35 mg·g-1(FW)，平均值為0.23 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為34%。草酸含量為0.09～0.23 mg·g-1(FW)，平均值為0.15 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為35%。馬來酸含量為0.02～0.09 mg·g-1(FW)，平均值為0.06 mg·g-1(FW)，變異系數(shù)為43%。

2.2 特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實中有機酸組分構(gòu)成比例及相關(guān)性分析

不同有機酸組分在特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中的構(gòu)成百分比分布情況見表3，蘋果酸最高，為51.8%，其次為乳酸，為13.95%，酒石酸為10.63%，抗壞血酸為9.99%，馬來酸最低，為0.31%。蘋果酸含量在不同特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中占總有機酸含量的15.85%～68.51%，種質(zhì)間變異系數(shù)為31.07%。乳酸含量在不同特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中占總有機酸含量的5.63%～28.03%，種質(zhì)間變異系數(shù)為50.49%。酒石酸在不同特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中占總有機酸含量的6.83%～17.24%，種質(zhì)間變異系數(shù)為30.44%。抗壞血酸在不同特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中占總有機酸含量的1.32%～16.57%，種質(zhì)間變異系數(shù)為46.92%。

表3 不同有機酸組分在特早熟、早熟荔枝種質(zhì)中的構(gòu)成百分比

不同特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實有機酸組分的相關(guān)性分析見表4，草酸與酒石酸、蘋果酸、乙酸、馬來酸、富馬酸、總酸呈正相關(guān)，與抗壞血酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸呈負(fù)相關(guān)；酒石酸與蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、總酸呈正相關(guān)，與乙酸、富馬酸呈負(fù)相關(guān)；蘋果酸與抗壞血酸、檸檬酸、琥珀酸、總酸呈正相關(guān)，與乳酸、乙酸、馬來酸、富馬酸呈負(fù)相關(guān)；抗壞血酸與乳酸、檸檬酸、總酸呈正相關(guān)，與乙酸、馬來酸、琥珀酸、富馬酸呈負(fù)相關(guān)；乳酸與馬來酸、琥珀酸、總酸呈正相關(guān)，與乙酸、檸檬酸、富馬酸呈負(fù)相關(guān)；乙酸與馬來酸、琥珀酸、富馬酸呈正相關(guān)，與檸檬酸和總酸呈負(fù)相關(guān)。

表4 特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實有機酸組分的相關(guān)性分析

3 討論與結(jié)論

果實中含有有機酸，調(diào)控果實的酸度，有機酸的種類和含量直接影響果實風(fēng)味和加工品質(zhì)。荔枝有機酸含量為蘋果酸優(yōu)勢型[2]。本研究通過高效液相色譜法對九份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)的有機酸組分及含量的進(jìn)行系統(tǒng)分析，明確了特早熟、早熟荔枝種質(zhì)果實成熟果肉中的有機酸的組分，各組分的含量范圍以及不同含量種質(zhì)的分布情況，特早熟、早熟荔枝種質(zhì)均含有草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、馬來酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸。其中蘋果酸含量平均值最高，乳酸次之，除了BTY檢測到11種有機酸組分外，其余8 份特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源均沒有檢測到甲酸。11 種有機酸組分中蘋果酸含量最高，其次是乳酸、酒石酸、抗壞血酸、富馬酸、乙酸、檸檬酸；而馬來酸、草酸、琥珀酸3 種有機酸含量較低。研究結(jié)果表明，有機酸組分中蘋果酸、乳酸、酒石酸與前人的研究結(jié)果相符[5-7,9-11]，而與蔡燦軍對荔枝發(fā)育期果實和成熟果的分析均未檢出乳酸不符[8]。特早熟、早熟荔枝種質(zhì)資源的有機酸組分及含量的差異，可為下一步荔枝優(yōu)良新品種的選育及新品種篩選提供理論依據(jù)。