雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗凍干工藝研究

劉思桐，何平有*，邱貞娜，劉青濤，張小飛，吳雅清，郁宏偉，劉 浩

（1.瑞普保定生物藥業有限公司，河北保定 071000；2.江蘇省農業科學院獸醫研究所，江蘇南京 210014）

目前國內大多數獸用活疫苗產品的凍干保護劑主要成分為脫脂牛奶、蔗糖、明膠等，保護劑配制簡便，溫度對抗原影響較大，在疫苗生產運輸過程中難以持續保證達到疫苗所需冷鏈保存溫度，導致溫度升高，造成疫苗效力降低。應用耐熱保護劑可降低活疫苗保存條件要求，從-15℃以下冷凍保存提升至2～8℃冷藏保存，國內傳統的獸用疫苗保護劑的研制相對滯后，使疫苗的長期保存和遠途運輸受到限制[1-3]。

凍干活疫苗生產中抗原含量、耐熱保護劑配制、凍干曲線設計是凍干活疫苗成功的關鍵因素。現有雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗37℃保存10d 抗原損失在0.5 個滴度以上，耐熱試驗抗原損失較大[4]，不利于疫苗的長期保存與運輸。現有凍干工藝凍干時長45h，凍干能耗較大。為降低抗原損失及能耗，本次試驗采用正交試驗方法，設計6 組耐熱保護劑配方，篩選出對雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗病抗原保護效果最佳的耐熱保護劑配方，并對凍干曲線進行進一步優化，獲得理想的凍干曲線，提高疫苗生產效率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 制苗用毒液

雞新城疫La Sota 株雞胚液、雞傳染性支氣管炎病毒H120 株雞胚液，均由瑞普（保定）生物藥業有限公司按照《獸用生物制品規程》 制備。

1.1.2 無特定病原雞胚

無特定病原種蛋購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。無特定病原雞胚由無特定病原種蛋自行孵化至適用日齡備用。

1.1.3 主要試劑

明膠、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮購自SIGMA；山梨醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、蔗糖均購自北京益利；水解乳蛋白，購自海克隆；海藻糖，購自南寧中諾生物科技有限公司；硫脲、半胱氨酸和維生素C 等購自北京拜爾迪生物技術有限公司。

1.1.4 主要儀器

東富龍冷凍真空干燥機，蘇凈安泰超凈工作臺，孵化器，漩渦振蕩器等。

1.2 方法

1.2.1 耐熱保護劑

（1）耐熱保護劑配制

參照文獻[5～7]，自行設計篩選出凍干保護效果較好的物質，如蔗糖、海藻糖、甘露醇、聚乙烯基吡咯烷酮、山梨醇等，將上述幾種物質通過正交設計結果進行耐熱保護劑的組方。

組分A：明膠、磷酸二氫鉀、山梨醇等耐熱基質按照配比去離子水溶解后高壓滅菌，共配制2 個組方。組分B：海藻糖、水解乳蛋白、維生素C 等適量去離子水溶解后過濾除菌，共配制3個組方。A、B 組方用前兩兩組合，共配制6 組配方，標記為TR1～TR6。

（2）疫苗配制

將6 個組方分別與病毒混合液（新城疫La Sota 株∶傳染性支氣管炎H120 株=1∶0.4）按1∶1.4 比例混合均勻，定量分裝，真空冷凍干燥，制成疫苗，分別標記為H1～H6。

（3）疫苗評價

按 《中華人民共和國獸藥典（2020 版）》 三部質量標準[8]進行疫苗性狀檢查和病毒含量測定（包括凍干前、凍干后）。耐老化試驗：取上述凍干疫苗3 瓶/ 樣品，置37℃放置10d，溶解后混合均勻進行病毒含量測定。

1.2.2 凍干曲線優化

（1）耐熱保護劑凍干參數測定

將篩選出的耐熱凍干保護劑與毒液按照1∶1.4 比例混合，測定混合液的共晶點和塌陷溫度。

共晶點檢測：將混合液以10℃/min 的速率由-50℃升溫至30℃，根據電阻和溫度曲線確定半成品疫苗的共晶點。

塌陷溫度檢測：混合液-55℃凍實后，真空度20Pa，以2℃/min 升溫。塌陷溫度為干燥、冷凍界面出現亮度變化時的溫度[9]。

（2）凍干曲線優化

應用優選保護劑TR4 配制疫苗開展凍干試驗，參照保護劑TR4 配制的半成品疫苗的共晶點和塌陷溫度，設計3 條凍干曲線，分別從預凍、一次干燥和二次干燥三個階段進行凍干效果研究。并按照前述方法進行疫苗性狀檢查、病毒含量測定（包括凍干前、凍干后）和耐老化試驗測定。

凍干曲線1：疫苗常溫入箱，開啟凍干機進入預凍階段，制品溫度到達-30℃保溫2h 確保制品全部凍實。2h 后抽真空升溫進入一次干燥階段，20h 升溫至-10℃，維持8h，之后以2℃/h 升溫至6℃，繼續升溫至20℃保溫2h，二次干燥完成，壓塞出箱。

凍干曲線2：將凍干箱溫度最短時間降溫至-30℃后將分裝好的疫苗半成品快速入箱，制品溫度到達-30℃保溫2h 確保制品全部凍實。之后抽真空進入一次干燥階段，8h 升溫至-8℃，維持6h，之后以2℃/h 升溫至8℃，繼續升溫至20℃保溫2h，二次干燥完成，壓塞出箱。

凍干曲線3：疫苗半成品常溫入箱，將板層溫度降至-5℃，維持1h，保證半成品表面形成薄層結晶，降低凍干箱壓力至0.2kPa，維持1h，之后降溫待凍干制品溫度達到-30℃保溫2h，2h 后抽真空升溫進入一次干燥階段，8h 升溫至-8℃，維持6h，之后以2℃/h 升溫至8℃，繼續升溫至20℃保溫2h，壓塞出箱。

1.2.3 凍干曲線重復驗證

取雞新城疫La Sota 株病毒液、雞傳染性支氣管炎病毒H120 株病毒液各3 批，按照1.2.1、1.2.2 試驗方法優選的保護劑配方TR4 和凍干曲線2 制備3 批疫苗，按照1.2.1（3）方法進行疫苗性狀檢查、病毒含量測定（包括凍干前、凍干后）和耐老化試驗測定，來驗證優選凍干工藝穩定性。

2 結果

2.1 不同保護劑配方疫苗評價結果

2.1.1 不同保護劑配方疫苗性狀檢測

從表1 看出H1～H6 疫苗凍干性狀均為海綿狀疏松團塊，色澤均勻，易脫壁，加入稀釋液后H2～H6 疫苗迅速溶解，H1 疫苗溶解緩慢。

表1 疫苗性狀檢驗結果

2.1.2 不同保護劑配方疫苗病毒含量檢測及耐老化試驗

從表2 可以看出不同保護劑配方疫苗，新城疫病毒效價為106.25-6.45EID50/ 羽份，其凍干損失為0.05～0.25 個滴度，雞傳染性支氣管炎病毒效價為104.24-4.5EID50/ 羽份，其凍干損失為0～0.26個滴度，從凍干損失上看H1～H6 疫苗均符合試驗要求。

表2 病毒含量檢測及耐老化試驗結果

由37℃10d 耐老化試驗結果可以看出，H4疫苗耐老化試驗檢測結果最優，37℃放置10d，新城疫病毒效價損失0.16 個滴度，雞傳染性支氣管炎病毒效價損失0.22 個滴度。

由上述結果可知H4 疫苗耐老化試驗抗原損失最小，故選用TR4 凍干保護劑配制疫苗進行后續凍干曲線優化試驗。

2.2 凍干曲線優化試驗

2.2.1 耐熱保護劑凍干參數測定結果

凍干參數測定為凍干曲線設計提供參考。凍干過程中預凍溫度須低于共晶點10℃左右，因此將預凍溫度設置為-30℃，且保持2h 以上，確保樣品凍實。原保護劑的塌陷溫度約為-22℃，由2.1 試驗結果篩選出的TR4 凍干保護劑中添加海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇，由保護劑TR4 配制疫苗的塌陷溫度為-17.4℃，明顯提高制品的塌陷溫度，而一次干燥的效率與塌陷溫度呈正相關[9]，后續凍干曲線優化試驗可通過提升一次干燥溫度，縮短升溫時間從而提升一次干燥效率。

2.2.2 凍干曲線優化試驗結果

從表3、4 可知，凍干曲線2 凍干時間最短，較凍干曲線1 縮短17h，較凍干曲線3 縮短2h，并且凍干性狀良好；凍干曲線3 疫苗產品性狀較差。凍干曲線2 疫苗雞新城疫病毒凍干損失0.14個滴度、雞傳染性支氣管炎病毒凍干損失0.24 個滴度，37℃放置10d 雞新城疫、傳染性支氣管炎病毒效價損失均小于0.3 個滴度；從疫苗性狀、凍干時長和病毒含量綜合比較分析TR4 疫苗優選凍干曲線2。

表3 不同凍干曲線疫苗性狀檢驗結果

表4 病毒含量及耐老化試驗測定結果

2.3 凍干曲線重復驗證檢測結果

由表5、6 可知，采用凍干保護劑TR4 和凍干曲線2 制備的3 批雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗性狀檢驗均合格，疫苗凍干過程中，新城疫病毒效價損失均在0.19 個滴度以內，雞傳染性支氣管炎病毒效價損失均在0.15 個滴度以內。3 批疫苗37℃放置10d，雞新城疫、雞傳染性支氣管炎病毒效價損失均在0.3 個滴度以內，證明該疫苗優選凍干工藝穩定。

表5 3 批疫苗凍干性狀檢驗結果

表6 3 批疫苗病毒含量檢測及耐老化試驗結果

3 討論

應用疫苗免疫預防是動物疫病防控最有效的技術手段，選用合適的保護劑對疫苗的質量及疫苗的運輸保存提供了重要的保障[10]。現有的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯活疫苗37℃保存10日抗原損失在1 個滴度以內，抗原受溫度影響較大[4]，本次試驗在原有基礎上進一步開展配方優化，提升疫苗的穩定性，同時開展凍干曲線優化設計，降低生產能耗。

本次試驗設計了6 組不同的凍干保護劑配方，優選的TR4 中含有海藻糖、聚乙烯基吡咯烷酮和甘露醇。海藻糖具有良好的抗冷凍脫水性能；聚乙烯基吡咯烷酮能提升玻璃轉化溫度并且抑蛋白變性，提高保護劑對病毒保護效果；甘露醇作為賦形劑，科學的用量能夠提升凍干毒液的塌陷溫度，使疫苗塌陷溫度由原保護劑-25.23℃提高至-17.41℃；制備的疫苗雞新城疫、雞傳染性支氣管炎凍干損失與耐老化試驗損失均小于

0.3 個滴度，保護效果好。

優選的凍干曲線2，預凍階段滿足制品溫度低于共晶點10℃左右，并且恒溫2h 保證制品完全凍實[11,12]；通過快速凍結制品縮短預凍時間，提高一次干燥溫度和干燥速率[13-15]，縮短一次干燥時間，將凍干時長由45h 縮短至28h，總凍干時長縮短了17h，并且保證了凍干效果。

用TR4 保護劑配制疫苗應用凍干曲線2 凍干進行了三次重復驗證試驗，三次試驗結果凍干性狀良好，雞新城疫、雞傳染性支氣管炎抗原損失與耐老化損失均小于0.3 個滴度，表明此次試驗篩選出的凍干工藝安全穩定可用于后續疫苗生產。

4 結論

本研究獲得雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯耐熱保護劑活疫苗的最佳凍干保護劑TR4，其凍干損失和耐熱損失均在0.3 個滴度以內，有效保證疫苗質量；本研究優選的雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯耐熱保護劑活疫苗最佳凍干曲線為凍干曲線2，在保證品質的情況下凍干時長較原凍干曲線減少17h，大大提高了生產效率。