豬胸膜肺炎放線菌分離鑒定與耐藥性檢測(cè)

呂鳳祿，趙 歡

（1.北鎮(zhèn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督中心），遼寧 北鎮(zhèn) 121300；2.北鎮(zhèn)市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊(duì)，遼寧 北鎮(zhèn) 121300）

在豬養(yǎng)殖過程中，不同日齡豬的呼吸道疾病成為臨床中的常見疾病，對(duì)不同階段豬的感染率和死亡率均較高，尤其是對(duì)仔豬的危害較大。引起不同日齡豬的呼吸道疾病的病原有許多，如細(xì)菌性病原引起的呼吸道感染、病毒性病原引起的呼吸道感染、支原體性病原引起的感染及寄生蟲性病原等[1，2]。相關(guān)研究表明，臨床中以細(xì)菌性病原引起的呼吸道感染較為常見，細(xì)菌性病原主要包括副豬嗜血桿菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌及支氣管敗血波氏桿菌鏈球菌等，尤其是豬胸膜肺炎放線桿菌最為常見，豬胸膜肺炎放線桿菌嚴(yán)重影響豬的健康生長(zhǎng)、也是豬死亡的重要因素之一，且在臨床中常以多種病原菌和病毒混合感染為主[3，4]。豬傳染性胸膜肺炎是由不同流行血清型的豬胸膜肺炎放線桿菌引起不同日齡豬的一種傳染性細(xì)菌性呼吸道傳染病，該病臨床中以呼吸困難、血性纖維素性胸膜肺炎、壞死性肺炎為主要的病理變化，引起嚴(yán)重的呼吸道感染且呈現(xiàn)急性死亡，其死亡率高達(dá)70%以上，該病成為危害養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重的細(xì)菌疾病，危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，在我國(guó)不同地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)中感染性胸膜肺炎的發(fā)病率有增無減，且呈上升趨勢(shì)。因此，對(duì)豬胸膜肺炎放線菌的防控具有重要意義。許多相關(guān)研究表明，在臨床中豬胸膜肺炎放線菌對(duì)臨床中常用的藥物會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的耐藥性，這給豬胸膜肺炎放線菌病的治療帶來一定困難，同時(shí)還威脅人們的健康[7]。本試驗(yàn)從采集的疑似患豬胸膜肺炎放線菌病的病料樣品中分離得到65株豬胸膜肺炎放線菌病，進(jìn)行耐藥性清情況監(jiān)測(cè)，為指導(dǎo)臨床合理用藥提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2021 年—2023 年采集某地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶中疑似患豬胸膜肺炎放線菌病不同日齡豬的咽拭子、鼻拭子及死亡豬的肺臟組織170份。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

對(duì)采集的疑似患豬胸膜肺炎放線菌病不同日齡豬病料組織170份和樣品組織（咽拭子、鼻拭子及死亡豬的肺臟）150份，在無菌條件下分別劃線接種于THB平板（含NAD）37℃培養(yǎng)12～18 h 后，接種于THB 液體培養(yǎng)基（含NAD）進(jìn)行純化培養(yǎng)，參照革蘭氏染色試劑盒說明書對(duì)純化培養(yǎng)的分離菌株進(jìn)行染色和顯微鏡觀察；參考文獻(xiàn)報(bào)道法取純化后分離菌株劃線接種于胰蛋白胨血瓊脂平板培養(yǎng)基上再接種金黃色葡萄球菌后，37℃培養(yǎng)12～24 h 后觀察是否有衛(wèi)星現(xiàn)象，同時(shí)調(diào)整菌液濃度，對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定試驗(yàn)。

1.3 細(xì)菌PCR鑒定

在生工生物工程（上海）股份有限公司合成豬胸膜肺炎放線菌鑒定引物，鑒定引物的片段大小為418 bp，以臨床分離菌株為模板用豬胸膜肺炎放線菌鑒定引物（5′-TTATCCGAACTTTGGTTTAGCC-3′；5-CATATTTGATAAAACCATCCGTC-3′）對(duì)分離菌株進(jìn)行PCR鑒定[8]。

1.4 藥敏試驗(yàn)

將臨床中分離的豬胸膜肺炎放線菌用K-B 藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其菌株藥敏試驗(yàn)的操作流程及判定結(jié)果參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013 年推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法，每1 種藥物菌做3 個(gè)重復(fù)，取其平均值，記錄每一株分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)每株豬胸膜肺炎放線菌分離菌株的耐藥性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

疑似豬胸膜肺炎放線菌分離菌株在THB 平板（含NAD）長(zhǎng)出特征性菌落形態(tài)；革蘭氏染色可見分離菌株成鏈狀排列或者單個(gè)的紅色短桿菌（見圖1）。分離的菌株胰蛋白胨血瓊脂平板培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型的衛(wèi)星現(xiàn)象（見圖2）。株疑似豬胸膜肺炎放線菌的培養(yǎng)特性、形態(tài)學(xué)及生化特性結(jié)果與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中報(bào)道的基本一致，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，65株分離菌株初步鑒定為豬胸膜肺炎放線菌。

圖1 分離菌株革蘭氏染色結(jié)果（1 000×）Fig.1 Gram staining results of isolated strains

圖2 分離菌株的衛(wèi)星現(xiàn)象Fig.2 Satellite phenomenon of isolated Strains

2.2 細(xì)菌PCR鑒定

65 株疑似豬胸膜肺炎放線菌分離菌株通過PCR 鑒定均擴(kuò)增出大約為418 bp目的基因條帶（部分分離菌株P(guān)CR 鑒定結(jié)果見圖3），65株疑似豬胸膜肺炎放線菌的分離菌株從分子生物學(xué)水平上鑒定為豬胸膜肺炎放線菌。

圖3 部分分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果Fig.3 Some isolates were identified by PCR

2.3 耐藥性分析

采用K-B 藥敏紙片法檢測(cè)65 株豬胸膜肺炎放線菌的耐藥性。由表1 可知，臨床中分離的65 株豬胸膜肺炎放線菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素、新霉素、大觀霉素、鏈霉素、阿莫西林、青霉素、紅霉素、土霉素、氟苯尼考等10 種藥物的耐藥率在50.8%～100%，對(duì)其他8種藥物的耐藥率在6.2%～33.8%。

表1 耐藥性檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Drug resistance test results

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外研究表明，豬胸膜肺炎放線菌病是豬養(yǎng)殖中主要的細(xì)菌性呼吸道傳染病之一，豬胸膜肺炎放線菌主要包含19種致病血清型，如豬胸膜肺炎放線菌1型-19 型，豬胸膜肺炎放線菌不同血清型的流行性具有區(qū)域性，各個(gè)血清型的分離菌株具有不同的致病性，各個(gè)血清型的分離菌株之間無交叉免疫反應(yīng)，目前沒有有效的豬胸膜肺炎放線菌病疫苗進(jìn)行預(yù)防，這也是導(dǎo)致豬胸膜肺炎放線菌在不同養(yǎng)殖場(chǎng)中廣泛流行的因素之一[9]。豬胸膜肺炎放線菌在我國(guó)不同地區(qū)的養(yǎng)豬場(chǎng)中廣泛分布與流行，應(yīng)該引起注意，做好防控措施。本研究從采集的疑似患豬胸膜肺炎放線菌感染不同階段豬病料樣品組織170 份中分離到65 株豬胸膜肺炎放線菌，說明豬胸膜肺炎放線菌引起某地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶中不同階段豬的呼吸道疾病的主要病原菌。因此，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶應(yīng)該注意豬胸膜肺炎放線菌病的綜合防控。臨床防治豬胸膜肺炎放線菌病過程中，不合理使用抗菌藥物現(xiàn)象較多，導(dǎo)致耐藥性產(chǎn)生，給治療帶來一定的困難[10，11]。采用K-B藥敏紙片法檢測(cè)65 株豬胸膜肺炎放線菌的耐藥性，結(jié)果顯示，從臨床分離的65 株豬胸膜肺炎放線菌對(duì)磺胺間甲氧嘧啶、慶大霉素、新霉素等10 種藥物的耐藥率在50.8%～100%，對(duì)其他8 種藥物的耐藥率在6.2%～33.8%，表明從該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)分離的豬胸膜肺炎放線菌對(duì)常用藥物產(chǎn)生不同的耐藥性。因此，在臨床治療豬胸膜肺炎放線菌病時(shí)，應(yīng)該合理使用抗菌藥物，同時(shí)配合環(huán)境消毒，才能提高治療效果。