仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及耐藥性 檢測

張新慧 陳鴻真

摘 ?要：本試驗采用細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗和PCR方法對采集的患呼吸道病死亡的仔豬鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料進行副豬嗜血桿菌分離鑒定；采用人工感染小鼠試驗和紙片擴散法（Kirby-Bauer，簡稱K-B法）分別檢測分離株的致病性和耐藥性。結果分離到1株副豬嗜血桿菌，并命名為HS-1株；分離株HS-1能引起小鼠發病與死亡，且死亡率為100％為致病性副豬嗜血桿菌；分離株HS-1對頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等8種藥物耐藥，以期為該地區仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

關鍵詞：副豬嗜血桿菌；致病性；藥敏試驗；仔豬

中圖分類號：S855.1+2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2023）03-0056-04

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌引起的豬的一種傳染性呼吸道疾病。該病常見臨床癥狀為纖維素性胸膜炎、呼吸困難及關節炎等；副豬嗜血桿菌病具有較高的感染率和致死率，給養豬業造成嚴重的經濟損失[1-2]。在養豬生產過程中，副豬嗜血桿菌病可通過不同途徑感染不同年齡段的豬，尤其是4～8周齡仔豬，且經常與豬圓環病毒病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征等免疫抑制性病毒病混合感染，導致動物死亡加快，給臨床診斷帶來一定的困難[3-4]。

仔豬副豬嗜血桿菌病已經成為多個國家和地區豬群中普遍流行的疾病之一，不同的國家與地區流行的仔豬副豬嗜血桿菌血清型具有差異性，導致疫苗制備存在一定的困難[5-6]。由于抗菌藥在臨床的廣泛應用，導致副豬嗜血桿菌產生了嚴重的耐藥性，給該病的臨床治療帶來了一定的困難，同時也嚴重危害著人們的健康[7]。

本試驗通過細菌分離培養、形態學觀察、生化試驗和PCR方法對副豬嗜血桿菌進行分離鑒定、致病性和耐藥性分析，以期為該地區仔豬副豬嗜血桿菌合理用藥及防控提供參考。

1 ?材料與方法

1.1 病料

2023年2月，采集某規模化豬場中因呼吸道疾病致死的仔豬鼻腔、肺臟、胸腔積液等組織或黏液樣本4份。

1.2 細菌分離與培養

在無菌條件下，將采集的鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料樣本接種于巧克力培養基上，在37 ℃恒溫培養箱（5％CO2）培養12～18 h后，挑取培養基上單個的典型菌落，革蘭染色，置于顯微鏡下觀察其形態。

1.3 細菌生化特性鑒定

挑取培養基上典型菌落，接種于胰酪大豆胨（tryptone soy broth，TSB）液體培養基中。在37 ℃恒溫培養箱中震蕩培養12～18 h后，用無菌的TSB液體培養基將菌液濃度調整為0.5個麥氏濁度，按照革蘭陽性菌的生化試劑盒說明書對分離菌株進行生化試驗鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定

參照杜炎斌等[4]報道的方法，設計副豬嗜血桿菌分離株鑒定引物。引物序列為F1：5'-TACGGCTACCTTGTTTTG-3'；F2：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3'，由深圳華夫基因股份有限公司合成，提取分離株HS-1的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，進行PCR鑒定。

1.5 致病性試驗

在無菌條件下，挑取巧克力培養基上單個的典型菌落，接種于TSB液體培養基中，在37 ℃恒溫培養箱中震蕩培養至對數生長期，利用菌落計數法對HS-1株進行計數，用TSB液體培養基將菌液濃度調整至107 CFU/mL。攻毒組和對照組分別為5只昆明系小鼠，攻毒組小鼠腹腔注射劑量為0.25 mL/只，對照組小鼠腹腔注射0.25 mL/只TSB液體培養基，在試驗期間觀察小鼠發病情況，并對死亡小鼠進行細菌學鑒定，試驗期為6 d。

1.6 藥敏試驗

藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）的要求對分離株進行藥敏試驗和耐藥性結果判斷。

2 ?結果

2.1細菌分離培養

疑似副豬嗜血桿菌的HS-1株在巧克力培養基上培養，利用革蘭染色鏡檢觀察其形態學（圖1）。HS-1株培養特性和形態學與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中報道的副豬嗜血桿菌的培養特性和形態學基本一致。

2.2 細菌生化鑒定結果

生化特性結果顯示，HS-1株硝酸鹽還原酶、接觸酶為陽性，分解葡萄糖、果糖；氧化酶試驗、吲哚試驗、脲酶試驗、甲基紅（Methyl red，MR）試驗及Voges-Proskauer（VP）試驗為陰性，不分解甘露醇。與《伯杰氏細菌鑒定手冊》中報道的副豬嗜血桿菌的生化特性基本一致，HS-1株生化特性鑒定結果為副豬嗜血桿菌。

2.3 細菌PCR鑒定

對分離的HS-1株進行PCR鑒定。結果顯示，PCR擴增出大約為822 bp的目的條帶（圖2）。對HS-1株的PCR產物進行測序，其測序結果與GenBank中的副豬嗜血桿菌基因序列同源性為98.9％～99.0％，表明HS-1株為副豬嗜血桿菌。

2.4 致病性試驗

攻毒組的5只小鼠在攻毒后2～3 d出現了精神沉郁、采食量減少、呼吸困難等臨床癥狀，攻毒的小鼠相繼出現死亡，第6天5只小鼠全部死亡，對照組小鼠無臨床癥狀，健康存活。剖檢攻毒組小鼠，采集病料組織，分離得到了副豬嗜血桿菌。致病性試驗結果表明，HS-1分離株為致病性副豬嗜血桿菌。

2.5耐藥性分析

采用紙片擴散法（Kirby-Bauer，簡稱K-B法）檢測HS-1株對常用抗菌藥的耐藥性，判定結果為耐藥（R）、敏感（S）、中敏（I）（表1）。

由表1可知，分離的HS-1株對頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松、多西環素、替米考星、氟苯尼考6種藥物敏感；對阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶、多黏菌素、恩諾沙星、環丙沙星、大觀霉素、林可霉素8種藥物耐藥。說明分離的HS-1株對臨床中常用的藥物具有不同的耐藥性。

3 討論

近幾年，隨著規模化養殖業的迅速發展，豬的飼養量呈現逐年增多的趨勢，但副豬嗜血桿菌病作為養豬業常見的傳染性疾病，可感染不同年齡段的豬，尤其是仔豬，具有發病急、高死亡率等特點，嚴重危害著我國養豬業的發展[1-4]。副豬嗜血桿菌廣泛存在于飼養環境中，可以通過多種途徑在不同豬群之間傳播，尤其是豬免疫力下降時更容易引發副豬嗜血桿菌病[7-8]。本試驗從患呼吸道病死亡的仔豬鼻拭子、肺臟、胸腔積液等病料中分離得到1株致病性副豬嗜血桿菌HS-1株，通過藥敏試驗結果顯示，分離株HS-1對頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢曲松等6種藥物敏感，對阿莫西林、氨芐西林、磺胺間甲氧嘧啶等8種藥物耐藥。說明分離的副豬嗜血桿菌對常用抗菌藥產生嚴重的耐藥性。因此，在臨床防治副豬嗜血桿菌中應進行藥敏試驗，選擇敏感的藥物進行交替使用，應注意副豬嗜血桿菌病的疫苗免疫，同時配合環境的消毒，提高其治療效果。

參考文獻

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[8] 王同兆，張付賢，雷連成．1株副豬嗜血桿菌血清4型的分離鑒定及耐藥性分析[J]．中國畜牧獸醫，2022，49（3）：1096-1105．